|
DNA片段的高效克隆 |
| |
陈 严 汤敏谦
中图分类号:Q523
文献标识码:A
文章编号:0253-9772(1999)05-0053-54
Efficient Cloning of DNA Fragment
CHEN Yan,TANG Min-qian
(TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co.,LTD,Dalian116600,China)
用Taq酶进行PCR扩增时, 其PCR产物的3 末端有一个附加的A碱基。因此,目前在克隆PCR产物时一般使用T-Vector。但T-Vector的价格比较昂贵, 而使用本试剂盒也可在短时间内使PCR产物与平滑末端载体进行高效连接。
PCR产物与平滑末端的载体连接时, 有必要除去3 末端的附加碱基, 并使其5 末端磷酸化。使用TaKaRa BKL Kit (Blunting Kination Ligation Kit) 可使这一连串的反应在短时间内完成。PCR产物的末端平滑化与磷酸化反应在一个反应体系内同时进行, 一次反应后便可得到能够用于连接的DNA片段。用于连接反应的PCR产物无需进行酶失活、除去dNTP等前处理, 末端平滑化与磷酸化反应结束后,利用MicropureTM-EZ离心30秒便可除去蛋白质。另外, 由于使用高效的DNA连接液, 可以在极短的时间内完成连接反应(原理见图1)。根据本试剂盒的原理, 除应用于PCR产物克隆外, 还可使任何的DNA片段在短时间内克隆于平滑末端载体中。
图1 TaKaRa BKL Kit的原理
1 试剂盒内容 (20次量)
10×Blunting Kination Buffer 50μl;Blunting Kination Enzyme Mix 25μl;Ligation Solution I 150μl;Control Vector (pUC118-HincⅡ/BAP, 50ng/μl)5μl;Control Insert (200ng/μl)10μl;ddH20 500μl;MicropureTM-EZ24个。
2 用PCR反应液直接进行BKL反应的操作方法
在微量离心管内制备下列反应液:PCR反应液2μl;10×Blunting Kination Buffer 2μl;Blunting Kination Enzyme Mix 1μl;ddH2O 15μl;合计 20μl。
上述溶液在37℃反应10分钟后, 将反应液转移至Micropure+EZ的过滤膜部分(过滤膜部分与微量离心管部分预先配置装好)。10 000～15 000 r/min离心30秒后, 取5μl滤液至另一个新的微量离心管中, 加入1μl (50～100ng/μl) 脱磷酸化处理的具有平滑末端的载体, 混合均匀。加入6μl Ligation Solution I混合, 16℃反应1小时。其反应液全量转化100μl的感受态细胞。
3 使用TaKaRa BKL Kit 进行PCR产物的克隆
以λDNA为模板, 使用TaKaRa Taq+反应得到的PCR产物的片段长度分别为200bp、500bp、1 000bp、1 500bp、2 000bp(图2)。利用TaKaRa BKL Kit将上述DNA片段克隆到pUC118的HincⅡ位点上。实验结果如表1所示。使用的JM109 Competent Cell的转化效率为7.0×108/μg pUC118。
图2各种PCR产物的电泳图
M.DL 2 000 DNA Marker,10μl;
1.200bpPCR反应液,5μl;
2.500bpPCR反应液,5μl;
3.1 000bpPCR反应液,5μl;
4.1 500bpPCR反应液,5μl;
5.2 000bpPCR反应液,5μl。
表1 各种PCR产物的克隆结果
Insert DNA 链长 (bp) 白色菌落／蓝色菌落 (／50ng pUC118 D[1] [2] 下一页
上一个医学论文： 一种鉴定油菜远缘杂种的细胞学方法
下一个医学论文： 隐喻理解加工机制的研究
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文