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一种鉴定油菜远缘杂种的细胞学方法 |
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吴建国 李再云 刘 焰 石春海 傅廷栋
中图分类号:Q343.5;Q321+.2
文献标识码:A
文章编号:0253-9772(1999)05-0051-52
A Cytological Method for Determining Wide Hybrid of Rapeseed
WU Jian-guo,SHI Chun-hai
Deptartment of Agronomy,Zhejiang University,Hangzhou310029,China
LI Zai-yun,LIU Yan,FU Ting-dong
Deptartment of Agronomy,Huazhong Agricultural University,Wuhan430070,China
在众多的染色体观察技术中，压片法由于其步骤简单、操作方便等特点，在油菜及其近缘种属植物染色体的研究中，得到了广泛应用（蓝泽蘧等，1994）。然而，通常观察的部位为种子根尖，由于远缘杂交结实率普遍较低，得到远缘杂种又极其珍贵，取其种子根尖来鉴定是否为真杂种则相当困难，同时，在鉴定附加系、单体与缺体等非整倍体时，取根尖观察也存在相似问题。如通过组培技术，来增加观察部位的数量，则在技术上要求过高，不是一种最理想的方法。我们采用幼小雌蕊观察法，能快速地鉴定当代单株的染色体组成。本文对以上三种方法进行了比较分析。
1 材料和方法
1.1 材料来源
甘蓝型油菜(Brassica napus,2n =38, AACC)与诸葛菜(Orychophragmus vilaceus,2n =24, OO)属间杂种的第四代群体中，鉴定出一属间五倍体（2n =50, AACCO）植株（Li等，1995；Wu等，1997）。将该属间五倍体杂种种子播于大田，连续套袋自交得第一代、第二代与第三代自交种子。以自交第一代中2n=41的植株为母本，人工去雄，与甘蓝型油菜进行回交，获得供细胞学观察用的种子。
1.2 组织培养技术与快速繁殖
用种胚培养方法鉴定单株的染色体组成。将属间五倍体自交第一代种子在70%酒精中处理5min，然后用0.1%升汞消毒15min，经无菌水洗涤4次后接种到培养基上。培养基成分为MS + 3mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA + 30g/L 蔗糖 + 8g/L 琼脂。待萌发出的小苗长出3～5片真叶且有腋芽时，将腋芽切下，分别接到新鲜培养基上，每一腋芽可发育成苗，且从基部愈伤组织长出许多小芽，取其茎尖和幼叶供细胞学观察。
1.3 细胞学方法
用压片观察法来进行有丝分裂计数。种子根尖观察法，将回交种子冷水浸泡数小时，置湿润滤纸上于25℃下萌发，待根长至1～1.5cm时，取种子于22℃下0.002 mol/L 8-羟基喹啉活体处理3h，用卡诺液固定24h，然后置于70%乙醇中在4℃下保存。组培苗观察法，取培养基上幼苗的茎尖及幼叶，置于22℃0.002 mol/L 8-羟基喹啉溶液中处理3h，其余步骤同上。幼小雌蕊观察法，剥取幼小花蕾中的雌蕊，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理5h，经卡诺液固定24h后，4℃下保存于70%乙醇中。观察时，取所用材料，在60℃下，用1 mol/L HCl水解10min，移至玻片上，加一滴10%改良的苯酚品红染液，压片镜检。
2 结果与讨论
在压片方法相同的情况下，同一类型植株（2n =41），不同的取材部位，其细胞学观察结果，差异极显著（表1）。其中种子根尖观察中，平均每个种子根尖有5.7个分裂相细胞可用于统计染色体数目。组培幼苗，平均每个材料仅有4.3个分裂相细胞可供计数。而幼小雌蕊则表现明显的优势，平均每个雌蕊有15.3个分裂相可供染色体计数，且染色体形态较好（图1）。
表1 2n =41植株体细胞观察结果
取材部位 材料数目 具分裂相细胞数目 平均
种子根尖 20 114 5.7
幼苗 7 30 4.23
雌蕊 15 229 15.3
图1经幼小雌蕊观察法，示2n =41的分裂相
由于我们所用的材料是属间杂种后代，其种子的生活力差异大，胚根生长极不一致，有的根尖因生活力差，分裂相少，染色体形态不佳，而给准确地[1] [2] 下一页
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