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银额果蝇B染色体特异性基因的初步研究 |
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遗憾的是，B染色体作为许多动物和植物遗传物质中的一员，其自身的基因组结构如何？在众多生物中有何功能？它怎样起源和进化等等一系列悬而未决的问题，将B染色体这一颇为广泛存在的生物现象摆到了当代基因组学界及至整个遗传学界和细胞生物学界的面前，已成为不可回避的挑战。
代表性差异法（representational difference analysis RDA）是最近出现的一种研究两基因组差异性的理想方法，结合了PCR技术、消减杂交和动态富集〔2〕。通过选择两种相近来源组织或细胞的基因组DNA，用一种适合的限制性内切酶消化，得到一系列限制性内切酶片段（ARF），两端连接寡核苷酸接头，利用PCR优先扩增小片段<1kb，制备代表性扩增子。通过三轮连续消减杂交，检测扩增子中的特异片段可富集105～106倍，普通琼脂糖凝胶电泳即可检测出特异片段。目前，RDA技术已应用到研究肿瘤组织与正常组织间的抑瘤基因丢失与瘤基因扩增、外源病毒感染引起的基因组改变及寻找新的遗传多态位点探针等方面。RDA方法与其它基因克隆方法相比，具有操作简单、快速、重复性好、灵敏度高、假阳性低等优点。
果蝇一直是基础遗传学和群体遗传学研究的好材料，在近4 000种果蝇中，迄今只发现两种果蝇含有B 染色体，银额果蝇（Drosophila albomicans）是其中之一〔3〕。银额果蝇易于实验室饲养，繁殖代时仅10～20天，其A染色体核型简单，仅为2n=6, 在中期易与B 染色体区别, 而且其B染色体频率在各地理群体中呈规律性分布，为研究B染色体的基因组提供了好材料〔4〕。在银额果蝇中，我们已发现了不同类型的单雌系、含B染色体及不含B染色体单雌系〔5〕。用含B染色体单雌系制备检测扩增子，不含B染色体单雌系制备驱赶扩增子，通过RDA技术，希望获得B染色体上的特异性基因。
1 材料和方法
1.1 材料
银额果蝇两个单雌系AKM46(含B染色体)和AGZ2(无B染色体)。25℃，光照，培养数天，收集幼虫。
1.2 RDA引物
R-Bam245 -AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGAG-3＇,
R-Bam125 -GATCCTCGGGGA-3 ;
J-Bam245 -ACCGACGTCGACTATCCATGAACG-3 ,
J-Bam125 -GATCCGTTCATG-3 ;
N-Bam245 -AGGCAACTGTGCTATCCGAGGGAG-3 ,
N-Bam125 -GATCCTCCCTCG-3 。
1.3 DNA制备
将幼虫剪碎，加入1ml DNA抽提液(10mmol/L Tris -HCl(pH8.0), 0.1mol/L EDTA(pH 8.0), 20 μg/ml 胰RNA酶, 0.5%SDS)过夜，苯酚氯仿抽提两次，乙醚抽提一次，乙醇沉淀，加TE溶解。
1.4 RDA差异片段
取1～2μg基因组DNA，用BamHI酶切消化，苯酚和氯仿抽提后，与接头R-BamHI连接，经PCR扩增，制备代表性检测扩增子和驱赶扩增子，第一轮消减杂交：用检测扩增子0.4μg和驱赶扩增子40μg混合, 液相杂交后, PCR扩增富集第一轮差异片段, 随后又将第一轮差异片段与驱赶扩增子混合, 进行第二轮和第三轮消减杂交：以第二轮差异片段100pg和驱赶扩增子40μg混合,经PCR扩增后, 得到第三轮差异片段。
1.5 差异片段回收与纯化
从聚丙烯酰胺凝胶电泳回收第三轮的6个差异片段。再经PCR扩增后，Nusieve(2%)凝胶电泳，切下电泳带，采用QIAquick Gel Extraction Kit，按操作说明书纯化。
1.6 差异片段克隆与测序
采用Original TA Clone Kit（Invitrogen Corp.）提供的载体pCR2.1，将差异片段连接在载体上，转入INV αF 菌株蓝白筛选(x-gal), 挑选白斑菌落, 抽提质粒，EcoRI酶切鉴定含插入片段的阳性克隆。质粒纯化后，用377自动测序仪(ABI PRISM Version 3.0)测序。
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