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中国南方汉族群体MPSI型Kpn I酶切位点的遗传多态性 |
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10岁)，因此，对胎儿及孕妇进行早期基因诊断及携带者检出具有重要意义。为了弄清中国人群中该基因内Kpn I位点的多态性是否与国外报道的存在差别，以便进一步了解这些多态性与MPS I发生的相关性，为今后的产前基因诊断等打基础。作者对162例无亲缘关系的正常中国汉族人的IDUA 基因的Kpn I RFLP进行了研究。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1样本 取居住广州地区，祖籍分别来自广东、福建、海南、四川、江西、湖南、云南等地的无血缘关系的健康中国汉族个体162人的静脉血，其中男性85人，女性77人, 用肝素抗凝。
1.1.2引物及试剂 按文献〔1〕合成扩增IDUA 基因内含Kpn I位点的450bp 片段的一对引物。IDK1：5 -AGG TCC TGC CTG GCT CCT GA- 3 ；IDK2 5 -GGC TGG GAG CAG AGC CCA CA-3 。所用试剂除dNTPs、Taq DNA聚合酶(GENDA, 加拿大)，100bp ladder、 Kpn I(GIBCO/BRL)，SDS、蛋白酶K，琼脂糖(Sigma)外，其余均为国产分析纯。
1.1.3仪器 PCR热循环仪GC-1型(PE公司，美国)，紫外分光光度仪(Shimadzu UV-120-02，日本)，高速台式离心机(TGL-16，上海)。M1P[90]5期L 郭奕斌 等:中国南方汉族群体MPSI型Kpn I酶切位点的遗传多态性 CmM2P[90]遗传HEREDITAS(Beijing)1999C21卷RmP[105]
1.2方法
1.2.1DNA提取及浓度测定 按我室常规方法进行〔3〕。
1.2.2PCR扩增 反应体系为30μL, 含10 mmol/L Tris-HCl(pH9.0), 50 mmol/L KCl, 1.5mmol/L MgCl-[2], 0.1% Triton X-100, 0.2 mmol/L dNTP, 上下游引物各20 pmol以及0.2～0.5μg DNA模板。扩增条件采用95℃30s，68℃45s，72℃45s，35个循环后72 ℃继续保温7min。扩增片段大小为450bp。
1.2.3多态性及其分析 450bp PCR产物含有Kpn I多态位点。该位点是由IDUA 基因亮氨酸密码子的第一个碱基T变为C引起的〔4〕。450bp扩增产物酶切后可产生390bp和60bp 两个片段。将PCR产物用少量1%琼脂糖凝胶进行快速检测，对有深、纯扩增带的样品直接进行Kpn I酶切分析。酶切反应采用：8μL PCR产物+2μL BSA(10×)+2μL NEB1(10×)+7.5μL DH2O+0.5μL Kpn I(10U/μL)，37℃酶解2～4h。然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染的方法检测酶切结果(见下述)。用χ2检验对实际结果与理论值的一致符合率进行统计学处理。
1.2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳 配制8%聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis=49∶1)。取2μL 100bp ladder作为片段长度标准, 取2.5μL PCR产物作为未切对照, 取不同类型酶切产物及家系Ⅱ的酶切产物各5μL加样, 调20mA电泳1h。
1.2.5银染 电泳毕, 将胶移入10%乙醇溶液中作用5min→换上1% HNO3溶液作用3min→用重蒸水洗两次, 每次数秒→换上0.012mol/L AgNO3溶液作用20min (此间配好还原液)→重蒸水洗两次，每次数秒→加还原液银染, 至带清晰为止→随即换上10% HAc, 固定5min→用重蒸水浸洗2min以上→制成干胶后照相、保存。
1.2.6等位基因传递规律的家系分析 对收集到的5个家系16名成员进行基因组DNA的制备、IDUA 基因内450bp片段的PCR扩增以及该片段内Kpn I酶切点的多态性分析，根据亲、子代的基因型分析A1、A2 在世代中的传递规律。
2结果与讨论
用Kpn I分别对162例(男85人，女77人)无血缘关系的正常中国汉族人的IDUA 基因的特异片段进行酶切的结果表明, 中国汉族人IDUA 基因内的450bp扩增片段的Kpn I位点具有多态性。等位基因1(A1 )无Kpn I位点，酶切后仍为450bp(见图1的 lane 2)，等位基因 2(A2)含有一Kpn I位点，酶切后可产生390bp和60bp两个片段见图1 lane上一页 [1] [2] [3] 下一页
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