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利用PCR |
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MINK基因为模板再次进行扩增，得到头尾相互重叠的两对片段，每一片段均小于300 对碱基。取PCR产物10μl加入等体积SSCP变性加样液95℃变性5分钟，两种不同条件下进行SSCP分析。(1) 4℃下经12.5%的中性聚丙烯酰胺凝胶（ExcelGel+ 48S DNA Kit Pharmacia Biotech 公司）电泳3小时。电泳后根据DNA银染试剂盒（DNA Silver Staining Kit, Pharmacia Biotech 公司）操作说明固定染色直至带型清晰。
1.3测序
SSCP结果显示异常的条带，对其PCR产物进行纯化。测序采用引物MINK 1F, MINK 1R双向进行，ABI PRISM 377测序仪上直接测序。
2结果与讨论
应用PCR-SSCP在对长QT的患者及正常对照者的研究结果表明，患者组标本及正常对组中照都出现了电泳条带的增减及位置的相对迁移，其电泳特征提示可能存在的杂合子及纯合子。图1显示, 在4℃下, 经12.5%的中性聚丙烯酰胺凝胶, 可见病人组及正常组均有异常条带的存在。
图1 人MINK基因的PCR-SSCP分析
1～8.对照组;9～17.LQTS病人。其中 丝氨酸纯合子(S/S): 3～5;半光氨酸杂合子(S/C):
6～7、10、12、14～16;半光氨酸纯合子(C/C): 1～2、8～9、11、13、17。
所得DNA经测序分析确证与已知MINK序列(EMBL-id: HSISK)相比，部分受试者中hMINK基因的第149位密码子发现AT→GC的转换（图2），其中S38纯合子在患者中0 例，在健康对照组中3 例；C38纯合子在患者中 5例，在健康对照组中 2例；C38杂合子在患者中3 例，在健康对照组中4 例（图1），这一变化将导致其编码的蛋白序列38位的丝氨酸（AGT）转变成为半胱氨酸（GGT）。因此, 在所研究的对象中, 等位基因中出现G的变化同时存在于LQTS患者及健康对照者中，提示人类MINK基因多态性的存在。
图2 SSCP结果的序列分析
C左.S/S;中.S/C;右.C/C。测序引物为反向引物MINK1R。
人类MINK基因编码的蛋白与KVLQT1所组成的(亚基共同组成α2β2四聚体的电压门控的钾通道，通过调节钾电流对于动作电位的复极化过程起着重要的作用〔7〕，已报道的两种位于hMINK上的突变D76N、S74L，均会导致QT间期的延长并表现出强的显性负效应〔2〕，属病理性突变。与上述病理性突变不同，在本研究中所发现的hMINK基因S38C的纯合子及杂合子在病人及健康对照者中均有发生，表明此突变的性质属于非病理性多态突变。该结果提示, 由该突变产生的丝氨酸突变为半胱氨酸类型的改变可能不会造成蛋白质构象的显著性变化, 从而不明显影响其正常的离子通道及生理功能，这与上述报道的病理性突变不同。在我们的研究中, 病人组中均未发现有D76N、S74L突变的存在。但是, 由于目前已经确定的与LQTS相关的基因共有5个, 包括: KvLQT1 (LQT1)〔8〕, HERG (LQT2)〔9〕, SCN5A (LQT3)〔10〕, MINK (LQT5)〔11〕 以及位于4q25～27位点其突变导致LQT4〔12〕，因此, 除MINK基因外, 对上述患者进一步进行其他4个相关基因的筛选是十分必要的。
作者简介:杨平(1971-), 男, 甘肃兰州人, 博士研究生, 专业方向:药理学。
作者单位：杨平 戴德哉中国药科大学药理研究室 江苏 南京 210009
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