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人APP基因C |
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>1.1质粒、菌株、细胞株
pBbluescriptⅡks-695 质粒含人APP基因cDNA695编码序列, 本室保存。pDORneo 带新霉素抗性基因的反转录病毒真核表达载体。由中国医学科学院肿瘤所程金科博士馈赠。pUC18 质粒，DH5α菌株，本室保存。细胞株：大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12，由中国医学科学院基础所蔡良婉教授馈赠。WO-2 鼠抗人Aβ1～16单克隆抗体杂交瘤细胞，本室保存。
1.2试剂盒、酶、分子生物学试剂
细胞总RNA 提取试剂盒为GIBCO/BRL 公司的Trizol 试剂盒, 反转录PCR试剂盒为Promega公司的Access RT-PCR 试剂盒, 测序试剂盒为Phamacia 的T7 Sequence 试剂盒。LDH测定试剂盒购自德国Centronic公司。其它分子生物学试剂均购自Promega、GIBCO/BRL、Phamacia、华美、友谊、中山等公司。
1.3表达载体的构建及筛选鉴定
利用BglⅢ, XmnI从质粒pBbluescriptⅡks-695中切出编码人APP基因C-末端105个氨基酸的cDNA片段(APP-CT)，将载体pDORneo先用EcoRI切开，再用Klenow酶补平，再用BamHI切开，将目的片段与载体片段用电洗脱法回收后，定向联接后转化DH5α形成重组体pDORneo-APPCT, 详见图1。酶切鉴定, 然后再将目的片段用EcoRI、HindⅢ, 亚克隆到pUC18 质粒，利用T7测序试剂盒进行测序鉴定。
图1重组载体的构建
1.4细胞培养和转染
PC12细胞的培养条件为高糖DMEM+10%胎马血清+5%胎牛血清+适量的双抗。用Lipofectin Reagent进行空载体及重组体的转染，用适当浓度G418进行抗性克隆的筛选。P[105]
1.5RT-PCR方法检测转染细胞的APP mRNA的表达
以Trizol试剂盒按说明书进行细胞总RNA的提取，然后用RQI RNase-free DNase 除去残存的DNA。用Acces RT-PCR kit进行RT-PCR反应，引物为K1 5 - (TTGGGCCCATGGATGCAGAATTCCGACAT) -3 及K25 - (TTGGATCCCGAG TTCTTCATCTTCT)- 3 。反应条件为48℃反转录45min，94℃灭活反转录酶2 min。扩增循环为94℃30 s，55℃30s，72℃1 min。共进行42轮循环。然后取10μl扩增产物用1％琼脂糖进行凝胶电泳与1 kb DNA Ladder比较。
1.6Western Blot方法检测细胞蛋白的表达
利用Trizol试剂盒进行全细胞蛋白提取，用考马斯亮蓝G250染色法定量。取适量蛋白进行Tris-Tricine SDS-PAGE电泳，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。用含5％脱脂奶粉的PBST封闭，用适当稀释度的WO-2抗体进行第一次杂交，再用碱磷酶标记的鼠抗人抗体IgG/AP进行第二次杂交，洗膜后加入生色底物BCIP和NBT显色。
1.7MTT法测量细胞的生长
细胞以2×104孔接种入96孔板，每孔100μl。按50ng/ml培养液加入姦?NGF, 每组设4孔, 培养液和NGF每两天更换一次。于接种后第1、3、7天利用MTT法测量细胞的生长情况。MTT浓度为0.5mg/ml, 37℃孵育4 h，弃去培养液，加入100μl/孔DMSO，稍振荡待甲赞产物充分溶解后, 置酶标仪上测OD570。
1.8细胞培养液和全细胞乳酸脱氢酶的测定
细胞复苏后用正常培养液培养24 h后，改用5%低血清培养液以减低血清中LDH对测定的影响。同时加入50ng/ml的β-NGF。待细胞长满瓶后，取50μl培养上清测定LDH。然后按100μl/1ml培养液加入9%Tritonx-100裂解细胞(37℃孵育4 h)，离心取50μl上清用于全细胞LDH的测定。
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