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中华眼镜蛇短链神经毒素cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达 |
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DNA已经得到了克隆〔6～8〕。
我们利用已知神经毒素基因序列，设计引物，用RT-PCR方法克隆了新的中华眼镜蛇(Naja naja atra)短链神经毒素cDNA，并在大肠杆菌中得到成功的表达。
1材料与方法
1.1材料
中华眼镜蛇(Naja naja atra, 产自福建省)购自上海铜川路蛇市场，宿主菌E. coli JM109, BL21(DE3), 质粒pT7ZZ由本室保存，质粒pGEM-T，限制性内切酶，T4 DNA连接酶，总RNA抽提试剂盒，Taq DNA聚合酶均为Promega公司产品，cDNA合成试剂盒为GIBCO BRL公司产品。
1.2方法
1.2.1总RNA的提取 眼镜蛇活杀取头，迅速取出毒腺，去除结缔组织，剪碎，加液氮研磨成粉末，加入变性溶液，其余步骤均按试剂盒说明书进行。以琼脂糖电泳来判断总RNA的质量。
1.2.2cDNA第一链的合成 按试剂盒说明书上的方法进行。
1.2.3PCR反应 取上述反转录产物2μl，按常规的PCR反应条件，先将反转录产物于94℃变性5min，加入2μl的Taq DNA聚合酶，按下列参数循环35次：94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸70s，最后一个循环72℃反应10min。
1.2.4重组克隆，DNA序列分析 将上述PCR产物用酚∶氯仿抽提纯化后，用T4 DNA连接酶将其连接到pGEM-T载体上。质粒抽提、酶切反应、琼脂糖电泳，T4 DNA连接酶反应，大肠杆菌转化均按文献〔9〕进行。重组质粒送上海皓嘉公司自动测序。
1.2.5诱导表达短链神经毒素基因 将重组pGEM-T质粒用表达引物进行PCR扩增5min, 加入94℃预变性的2μl Taq DNA聚合酶，按下列参数循环35次∶94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸50s，最后一个循环72℃反应10min。用Klenow酶补平，并用BamHⅠ和SacⅠ双酶切，克隆到pT7ZZ载体中。将重组pT7ZZ质粒转化E. coli BL21(DE3)，37℃平板培养过夜。挑取单菌落转接于新鲜LB培养基，37℃摇床8h左右，以2%接种量转接新鲜LB培养基，37℃摇床至OD600 0.4～0.6，加终浓度1mmol/L IPTG诱导表达，继续培养3h。取少许表达菌进行SDS-PAGE 电泳检测。
2结果与讨论
2.1RT-PCR法获短链神经毒素cDNA序列
我们用总RNA抽提试剂盒提取蛇毒腺总RNA，经电泳检查后看到28S和18S两条rRNA条带，说明总RNA无明显降解。据已报道的神经毒素基因序列，经微机分析，设计两个引物。
引物 1:5 AAGATGGAAACTCTGTTGCTGACC3
引物 2:5 AAGTCAAAGACAGTAGTGGAGAAGG3
引物 1 设计在起始密码子位点，引物 2 为神经毒素基因3 端非编码区的互补序列。以上述合成的cDNA为模板，进行PCR反应，扩增产物经2% 琼脂糖电泳检查，可清楚地看到一条383bp左右的扩增产物（图1）。
图1RT-PCR产物经2%琼脂糖电泳分析
1.DNA 分子量;2.短链神经毒素cDNA
2.2短链神经毒素cDNA的克隆和序列分析
PCR产物经酚∶氯仿（1∶1）抽提纯化后，与pGEM-T载体连接。连接产物转化大肠杆菌JM109，经质粒DNA少量制备和限制性内切酶酶切鉴定后，获数个阳性克隆。随机挑选一个阳性克隆，进行序列测定。测得序列及其推导出的氨基酸序列如图2所示。同已报道神经毒素基因序列进行比较，可得前21个氨基酸（5～68bp）为信号肽序列〔10, 12〕。从第22个氨基酸残基开始为功能区（69～254bp），共62个氨基酸残基。与Chu, R. C.和Yang, C. C.报道的中华眼镜蛇神经毒素cDNA有很高的同源性，只有2～3个氨基酸差别。与银环蛇(Bungarus multicictus)神经毒素基因相比较，除了与维持其空间结构和功能有关的保守残基及信号肽序列比较保守外，其余同源性不高。
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