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异源位点特异性重组系统在植物中的研究 |
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yr的游离-OH相连。这是一个转酯过程, 保存了DNA链断裂时的能量, 因而重组过程不需要附加能量; (4) 重组酶相连的断裂链与另一位点处断裂链的5 -OH端相连, 此时两DNA链中的一条分别与对方交叉相连; (5) 交叉相连的DNA链经旋转形成Holliday中间体; (6) Holliday中间体分枝迁移数个碱基后, 另一条链再断裂并与对方的断裂链重接, 这时就完成了重组过程, 实现了交换。在这三类重组系统中重组酶是除重组位点外的唯一必需因子。重组位点只需34或31bp基本结构即可行使功能, 三类重组酶都是单链多肽, 同时重组过程又不需要高能辅助物。这些优点给研究者在植物中研究位点特异性重组带来了方便。
3 异源位点特异性重组系统在植物中的重组
异源重组系统能在植物细胞内行使功能。已进行位点特异性重组研究的植物有烟草〔2～7, 11, 17, 19, 21〕、拟南芥〔4, 9, 14, 15, 19, 22〕、玉米〔16, 18, 20〕、番茄〔12〕、矮牵牛〔13〕和水稻〔16〕。Dale和Ow〔2〕最早在烟草细胞中进行了位点特异性重组的研究, 研究表明植物细胞具有支持Cre/lox 重组系统的能力。虽然反应只是发生在质粒上, 但其为位点特异性重组系统在植物中研究开了先河。位点特异性重组方式可以分为: 整合(插入)、切离、倒位及染色体易位等。如果在一个分子内有两个重组位点, 若二者反向定位: 首-首(或尾-尾)相连, 重组后则发生倒位; 若同向定位: 首-尾(或尾-首)相连, 重组后则发生切离。如果两个分子分别有一个重组位点, 二者可发生共整合、插入或染色体间的易位等。根据重组涉及到的结构可分为转基因重组和染色体重组。
3.1 转基因的重组
因为位点特异性重组系统对于植物是异源的, 必须通过转基因方式向植物中导入异源重组系统的元件: 重组位点和重组酶基因。它们可由载体转化至植物细胞中。已报道转基因的重组方式包括在植物细胞中载体内部基因的切离〔2, 16, 18, 21〕、倒位〔2, 21〕, 载体间的共整合〔2, 16〕, 载体整合进染色体〔10, 14, 15〕以及由T-DNA随机整合至植物染色体上的外源转基因的倒位〔9, 13, 19〕和切离〔3, 4, 17, 19, 20, 22〕。
3.2 染色体的重组
染色体的重组不仅可以在体内进行, 也可以在体外发生。在植物体内, 染色体重组可引起染色体间易位, 染色体内部片段的倒位、切离等染色体重排; 在体外, 染色体重组可引起染色体的断裂。
3.2.1 染色体间的重组 两个重组位点位于不同的染色体上, 如果它们的方向相对着丝点是相同的(具有方向性的重组位点的头部都是指向或背向着丝点), 经重组, 导致染色体易位。重组发生在两个已整合进染色体的重组位点间〔7〕(图1): 一个重组位点(rs )后有一个报告基因, 另一个重组位点(rs )位于植物启动子(Pr如35S启动子)和重组酶基因之间。通过报告基因的表达, 检测重组的发生。
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