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乙型 丙型 庚型肝炎病毒多重感染研究 |
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研究证实，GBV-C和HGV两者具有
高度的同源性，为庚型肝炎病毒的不同株，一些流行病研究资料也证实，庚型肝
炎病毒与丙型肝炎病毒具有相同的传播方式。本文对90例HCV RNA阳性的患者血
清及10例抗-HCV阳性的献血员进行了双重感染研究，结果如下：
材料与方法
一、材料
1.血清样品：90例HCV RNA阳性样品来自本院的门诊病人。
2.HGV RNA质控血清来自我国河北地区HBsAg阳性献血员，并经日本自治医
科大学证实HGV RNA阳性。
3.GBV-C参照血清：07648F9及52953：236血清均由Abbott赠送。
4.HGV NS5区PCR试剂盒来自本研究所。
5.HGV NS3区PCR试剂盒由本研究所生产，HGV NS3区外引物序列按文献报道合
成［３］，内引物正链5′-CATTCVAAGGCGGAGTGYGC-3′，负链5′-TCYT
TACCCCTRTAATAGGC-3′。
6.HCV RNA PCR试剂盒由本研究所提供，按文献方法进行［４］。
7.HBV免疫PCR试剂盒由本研究所提供，按文献报道方法进行［５］。
8.HBsAg EIA试剂盒上海科华生物公司产品。
9.HBeAg、抗-HBe EIA试剂盒为本研究所产品。
二、方法
1.HGV NS3区PCR：采用异硫氢酸胍裂解法，HGV RNA提取方法及PCR程序如
下：
(1)提取RNA：取血清20 μl加裂解液(含异硫氢酸胍)80 μl，混匀后置室温
5分钟，加入氯仿：异戊醇(49∶1)40 μl，稀释液(含RNasin)80 μl，10 000 r/min
离心10分钟，吸取上清液100 μl，加入等体积异丙醇(或-20℃保存)，12 000
r/min离心15分钟，吸去上清，沉淀物含HGV RNA。
(2)逆转录：在上述含HGV RNA原管内加入逆转录反应混合液(含AMV Buffer
dNTP及HGV引物)10 μl，70℃ 1～2分钟后，加入AMV反转录酶3～4个单位，42℃
40分钟后即可进行PCR扩增。
(3)第一次PCR：在逆转录原管内加入第一次PCR反应混合液(含缓冲液、引物
及1单位Taq酶)20 μl，石蜡油封顶，超薄管扩增程序94℃ 30秒，55℃ 30秒，
72℃ 45秒35个循环。
(4)第二次PCR：取第一次PCR产物3 μl，加第二次PCR反应液(含缓冲液引物
dNTP及1单位Taq酶)30 ml，在同一条件下扩增35个循环。
2.HGV NS5区PCR：引物设计与操作方法按文献方法进行［６］。
3.PCR产物的检测：采用聚丙烯酰胺(PAGE)电泳技术检测PCR产物，NS5区第
一次PCR产物380 bp，第二次PCR产物为210 bp；NS3区第一次PCR产物158 bp处有
cDNA带，及第二次PCR产物83 bp处有cDNA带为HGV RNA阳性。
结果
1.90例HCV RNA阳性患者中HGV RNA检测结果：90例HCV RNA阳性患者中8例
HGV RNA阳性，阳性率为17.8%。
2.HGV RNA质控血清灵敏度检测结果：取参照血清100 μl加入无菌小牛血
清900 μl定为10-1，依次稀释至10-6。结果表明，原血清10-1～10-4为强阳性，
10-5为阳性，10-6为HGV RNA阴性(附图)。
3.GBV-C参照血清HGV RNA检测结果：应用HGV NS3区套式PCR技术检测，
Abbott的两份样品52953∶236及07648F9均为阳性。
M分子量标志物：Hae Ⅲ PGEM3DNA1～7分别上一页 [1] [2] [3] 下一页
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