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应用PCR方法检定单核细胞增多性李斯特菌 |
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Conclusion PCR can be used in rapid, sensitive and specific identification of LM.
【Key words】 Listeria monocytogenes Polymerase chain reaction
单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌)可以引
起食物中毒，导致李斯特菌病(Listeriosis)。从食品中分离鉴定该菌的传统方法费
工、费时。免疫学方法和基因探针已用于单增李斯特菌的快速检测，但前者只能
达到属水平的特异性，后者敏感性差。
本实验针对单增李斯特菌的重要毒力基因hlyA进行检测，建立了该菌的PCR诊
断方法，并以人工污染牛奶为例，初步探讨了从复杂的食品标本中制备模板的方
法。
材料与方法
1.细菌和培养：实验用54株李斯特菌国际标准菌株和21株无关菌由本室保存，
33株李斯特菌国内食品分离株由中国商检研究所和重庆市卫生防疫站提供。采用
常规方法培养细菌，所用李斯特菌均经过传统鉴定［1，2］。
2.PCR分析：按发表的hlyA全基因序列［3］，并考虑单增李斯特菌不同型之间
hlyA基因内的碱基差异［4］，设计出一对引物，于本院八所合成并纯化。引物序
列如下：
Primer 1上游 5′-CTGAATTCGGCTGTTA-CTAAAGAGCAGTTGC-3′
Rrimer 2下游 5′-ATGGATCCTTAGCCCC-AGATGGAGATATTTCTA-3
′
扩增按照常规进行，完毕后行琼脂糖凝胶电泳［5］。
3.扩增产物鉴定：扩增产物用Hind Ⅲ酶切鉴定［6］，并行Southern blot分析，
Southern转移按照文献［6］进行，基因探针标记和杂交显色采用北京医科大学药
学院试剂盒，探针通过生物素标记和碱性磷酸酶系统检测。
4.对我国食品分离李斯特菌的检测：用建立方法对33株从国内食品分离的李
斯特菌进行鉴定，同时以生化鉴定和溶血试验作为对照。
5.对人工感染牛奶的检测：在经培养未发现李斯特菌的市售新鲜袋装牛奶中
接种单增李斯特菌1 472株(每毫升牛奶含4～4×106个菌不等)，按文献方法增菌培
养［1］。主要采用以下两种方法处理样品，制备扩增模板：①固相载体捕获特异
核酸(本所试剂盒)，②改进的化学抽提方法［7］，有机溶剂抽提后，其沉淀用生
理盐水洗两次，溶于适量去离子水，加热煮沸10分钟，离心取上清用于扩增。
结果
1.PCR扩增产物鉴定：扩增可获得预期743 bp的片段，对单增李斯特菌54 005
株和1 472株的扩增产物用Hind Ⅲ进行酶切鉴定，可得到428和315 bp预期大小的
片段。Southern blot后扩增产物可特异的显色。
2.PCR扩增特异性和敏感性：扩增具有极好的种特异性，31株单增李斯特菌标
准株均得到阳性扩增，其他李斯特菌和无关菌扩增结果为阴性(附表)；以单增李
斯特菌1 472株为例，纯培养检测的敏感度可达55个菌(图1)。
3.对我国部分食品分离李斯特菌株的PCR检测：33株李斯特菌国内食品分离株
中，18株PCR扩增为阳性，为单增李斯特菌。其余的15株PCR扩增阴性，英诺李斯
特菌，PCR检测与生化鉴定结果一致。
4.模拟样品的检测：通过固相载体法，经过24小时的培养，可达到600～6 000
菌/ml牛奶的敏感度；而通过化学抽提法，经过25小时的培养，敏感度可达4菌/ml牛
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