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荧光法测定血清脂质过氧化物的最佳反应条件 |
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张建新
荧光法测定血清脂质过氧化物浓度具有高灵敏度，选择性好，简便快速的优
点。分光光度法［1］，荧光法［2］和高效液相色谱法［3］分析健康成人血清丙二
醛(MDA)水平差异很大。大多数文献没有对血清脂质过氧化物酸水解产物MDA与硫
代巴比妥酸(TBA)的反应条件进行深入研究。我对反应用的酸的种类、酸度、反
应时间和抗氧剂等重新考察，建立荧光法测血清脂质过氧化物的最佳反应条件。
本法测定的健康成人血清MDA水平与Knight等［3］用HPLC法测定的参考值十分一致，
现报道如下。
1.材料和方法：TBA工作液29 mmol/L，MDA标准贮备液10 mmol/L(用1，1，3，
3-四乙氧基丙烷配制)，TBA和1，1，3，3-四乙氧基丙烷购于Sigma化学公司。MDA
标准溶液由标准贮备液用去离子水稀释得0.5～10 μmol/L(MDA浓度由1，1，3，3
-四乙氧基丙烷化学计量值表示)。谷胱甘肽(GSH)还原型(购于Sigma化学公司)，
正丁醇，Na2-EDTA·2H2O等其他试剂均为国产分析纯。Hitach 650-65荧光分光光度
计。采集空腹静脉血样，分离血清。两天内分析或-20℃存放待分析。健康成人血
清为献血者血清。病理血清为住院患者血清。按表1分析程序进行测定。以550 nm
为激发波长，在550 nm处测正丁醇萃取物的荧光强度，根据标准曲线法或直接比较
法定量。血清脂质过氧化物水平以丙二醛浓度表示。
测定结果以均值(标准偏差)表示，不同情况下
表1 血清脂质过氧化物测定
步 骤 空白 标本 标准
(1) 10 ml洁净具塞试管 0.100 ml 0.100 ml
(2) 酸溶液 2 ml 2 ml 2 ml
(3) TBA工作液 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
(4) 90～100℃水浴反应 1小时 1小时 1小时
(5) 冷却，正丁醇 3.00 ml 3.00ml 3.00 ml
(6) 混匀器上萃取1分钟，在3 000～4 000 r/min下离心分离
血清MDA水平经方差分析和t检验。
2.结果和讨论：
(1)萃取时间：血清脂质过氧化物与TBA反应物MDA·TBA2，在混匀器上萃取
30秒后，荧光强度达稳定，故萃取1分钟足以满足要求。
(2)酸的种类和不同溶剂配制的TBA工作液(1+1 HAc，0.01 mol/L NaOH，50%
乙醇)对荧光强度的影响：经试验MDA·TBA2荧光强度与反应用的酸的种类(盐酸、
磷酸、高氯酸和硫酸，浓度均为0.6 mol/L)无关，与不同溶剂配制的TBA工作液无
关。但是用1+1 HAc配制的TBA溶液，空白荧光强度很高(约为其他两种情况下的
30倍)，这可能是HAc中杂质，醛类物质与TBA反应所致。作者认为不能用HAc作为
水解用的酸或用来配制TBA工作液。
(3)荧光强度与反应酸度的关系：本研究采用大多数文献所选用的反应温度和
时间(100℃水浴和1小时)，考察标准和标本的荧光强度和所用的水解溶液的酸度
关系，结果见附图。从附图可知MDA标准在［H+］=1 mol/L～pH 2.0酸度范围内，荧
光强度
标准浓度：6 μmol/L
附图 标准和标本的荧光强度和反应酸度关系达一平台，而标本在酸度［H+］=
1 mol/L～0.6 mol/L和pH 1.0～pH 3.0范围内有两个较好的荧光强度平台。标本在第
一平台(［H+］=1 mol/L～0.6 mol/L)下荧光强度与反应时间的关系(0.6 mol/L HCl和
反应温度100℃)：经试验标准和标本荧光强度与反应时间关系见表2。从表2可知，
标准在反应30分钟后荧光强度达平台，而标本的荧光强度随反应时间一直显著上升，
抗氧化剂在此酸度情况下不能抑制标本的自动氧化问题，因此第一平台不能作为测
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