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妊娠早期小鼠子宫内膜层粘连蛋白定位 定量及对胚泡植入的作用 |
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lastocyst; Implantation; Immunofluorescence; Immunohistochemistry; Image analysis; mouse
人类和哺乳类动物胚胎着床是个很复杂的过程，受多种因素影响和调控，其中包括可溶性分子，如雌激素、孕激素、前列腺素及宫腔内多种酶和K+、Na+、Ca2+等离子。近年来研究发现，一些不溶性的细胞外大分子如细胞粘附因子中纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、血纤维蛋白和XIII因子等在胚胎着床及发育过程中也起着很重要的作用。
1979年，Timple和Martin［1］首次提出，细胞外基质中存在着一种重要的非胶原糖蛋白，分子量为950 000，并命名为层粘连蛋白(laminin，LN)。研究证明，LN具有多种生物学活性，如促进细胞粘着、铺展、移动，调节细胞的增殖与分化［2］及肿瘤细胞的转移过程［3］。1991年，Carnegie［4］在大鼠胚泡体外培养研究中，证实LN与FN(纤维粘连蛋白)的存在对胚泡粘附及内细胞团生长均起促进作用。目前有关子宫内源性LN的研究较少，尚无对LN进行定量分析的报道，本研究应用间接免疫荧光法、免疫组织化学ABC技术及图像分析法，探讨了动情期与妊娠早期小鼠子宫内膜LN的表达，及LN抗体对胚泡着床的抑制作用，为研究胚泡着床机理提供形态学依据。
材料和方法
1.主要试剂
LN源于小鼠EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)瘤，LN与LN多克隆抗体(兔抗小鼠)均由北京医科大学细胞生物学系制备提供。ABC药盒购于美国Vector公司。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG购于北京中山生物制品有限公司。冷冻保护剂PVA(polyvinyl alcohol type Ⅱ)的主要成分是聚乙烯醇，由本实验室自制。
2.动物
选用成年雌性昆明小鼠共62只，体重25～35g，其中35只用于内源性LN实验，其余27只用作外源性LN实验。雌、雄小鼠按2∶1合笼，次日清晨检查，发现阴栓为妊娠第1d(D1)。
3.子宫内膜LN免疫组织化学定位
为证实LN在小鼠子宫内膜的确切定位我们采用了以下两种方法进行比较和观察。
3.1 免疫荧光方法：取动情期及妊娠D1～D6小鼠子宫角中部各2～3段，每段0.3～0.5cm，部分组织块立即放入预冷(-160℃)的异戊烷内30～45s，再存入液氮内；或将子宫组织放在冷冻包埋剂PVA中，直接投入液氮内存放。将上述组织用Leitz1720型恒冷箱切片机制成冷冻切片，厚6μm。一抗为兔抗小鼠LN抗体(1∶1 000稀释)，在4℃冰箱中孵育20h。二抗为FITC标记的羊抗兔IgG(1∶5稀释)，37℃温箱中孵育45min，甘油-PBS封片后，Olympus荧光显微镜下观察，摄片。
3.2 免疫组织化学ABC法：取上述部分子宫组织，用4%多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，制成6μm厚的石蜡切片，贴在预先涂好防脱片剂的载玻片上，37℃烤箱内烘干后进行ABC法免疫组织化学染色，用上述一抗(1∶800稀释)，在4℃中孵育24h，二抗为生物素标记的羊抗兔IgG抗体(1∶200稀释)，室温孵育1h，ABC复合物室温孵育30min，H2O2-DAB显色。
方法特异性对照均采用PBS替代第一抗体，其余步骤相同。
4.植入前后小鼠子宫内膜LN原位定量
小鼠动情期子宫与妊娠D1～D6子宫各取5例，冰冻切片后进行上述免疫组织化学染色，方法特异性对照仍采用PBS替代第一抗体，用Q-550IW图象分析系统(Leica公司)测定每天子宫内膜LN的相对含量。在光学显微镜下，沿着内膜上皮和基膜每例随机测5个单位面积，各组LN的相对含量以±s 表示，各组间用ANOVA、继以Newman-Kculs检验进行统计学处理。
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