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人参总皂甙对造血生长因子活性及其mRNA表达的影响 |
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poiesis by activating GM-CSF and IL-6 mRNA expression of BMSC. Mφ and lymphocyte in hematopoietic inductive microenvironment. This mayht be one of the mechanisms for the promoting vital energy and hematopoiesis of panax ginseng.
【Key words】 Total saponins of panax ginseng; Hematopoietic growth factor; Gene expression; In situ hybridization
人参是中医临床“补气”要药，有“补气生血”之功效，人参皂甙是其主要的药物成分［1］。本室既往工作证实：人参总皂甙(TSPG)能促进贫血小鼠造血功能的恢复，亦能在体外促进造血祖细胞的集落形成［2，3］。血细胞的生成与造血生长因子(hematopoietic growth factors, HGF)的调控密切相关，造血祖细胞的增殖与分化依赖于HGF的刺激，造血祖细胞体外培养术能检测HGF的生物活性［4］。为探讨TSPG促进造血与HGF的关系，本研究TSPG对粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-6(IL-6)等表达的影响，旨在阐明人参“补气生血”的细胞与分子生物学机理，以弘扬和促进祖国传统医学的发展。
材料和方法
1. 材料
1.1 实验动物:8～12周龄纯系615雄性小鼠60只，体重18～22g，重庆医科大学实验动物中心提供。
1.2 人参总皂甙(total saponins of Panax ginseng, TSPG):四川省中药研究所提供，皂甙纯度90%以上。IMDM培养液配制，过滤除菌。
1.3 主要试剂：RPMI-1640、IMDM培养基(GIBCO公司产品)，重组人红细胞生成素(美国Amgen公司产品)，甲基纤维素(Sigma公司产品)，粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和爆式集落促进活性(BPA)(军事医学科学院提供)，地高辛标记试剂盒(德国宝灵曼公司产品)。
2.方法
2.1 骨髓基质细胞条件培养液：(BMSCM)制备：参照Dexter等［5］骨髓细胞长期培养方法，建立小鼠骨髓基质细胞系。培养2～3周待基质细胞长满瓶底后，以0.25%胰酶消化收集基质细胞，含10%小牛血清的IMDM培养液传代培养。TSPG组，在培养体系中加TSPG(终浓度20mg/L)；对照组，加等量IMDM培养液。第6d收集培养上清。
2.2 脾细胞培养上清液(SPCM)和腹腔巨噬细胞培养上清液(PMΦCM)制备：方法同文献［6］。实验组加TSPG(终浓度20mg/L)；对照组加等量的IMDM培养液，培养4d收集培养上清液。
2.3 造血生长因子活性检测：按本室常规方法培养早期红系祖细胞(BFU-E)、粒-单系祖细胞(CFU-GM)和巨核系祖细胞(CFU-MK)［3］。培养体系中分别加入10%(V/V)BMSCM、PMφCM或SPCM，以每种植5×104个骨髓有核细胞(BMC)所生成的BFU-E集落数表示爆式红系集落刺激活性(BPA)的水平；以生成的CFU-GM集落数表示粒巨-噬细胞集落刺激活性(GM-CSA)的水平；以每种植1×105BMC生成CFU-MK的集落数表示巨核细胞集落刺激活性(MK-CSA)的水平。
2.4 cDNA探针制备：GM-CSF和IL-6 cDNA探针制备方法同文献［7］。用地高辛-11-dUTP(digoxigenin-11-dUTP)为标记物，随机引物法标记GM-CSF和IL-6 cDNA探针。标记程序参照宝灵曼公司Dig-High Prime试剂盒操作手册进行。
2.5 原位杂交：
2.5.1 细胞培养与涂片制备：BMSC和PMφ直接培养在载玻片上，在培养终止前24h加入TSPG(20 mg/L)。SPC培养同文献［6］，培养终止后经细胞离心涂片到载玻片上，载片经4%多聚甲醛固定，75%乙醇保存备用。
2.5.2 杂交前处理：杂交前载片处理方法同文献［7］。
2.5.3 预杂交与杂交：每张载片加预杂交液20μl,42℃湿盒内30min上一页 [1] [2] [3] 下一页
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