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钙调素拮抗剂对HeLa细胞S期进程的影响 |
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azine(TFP); S phase; HeLa cells
钙调素(calmodulin,CaM)与细胞增殖、分化、转化密切相关，虽然已有一些文献报道了它在不同细胞中的作用，但对细胞周期S期进程及引擎分子与相关调控因子的作用的报道较少。为此，我们利用TdR双阻断法，获得了S期细胞，研究了CaM在HeLa细胞S期进程中的作用及其作用机理。
材料和方法
1. 材料
HeLa细胞(本室存)、(γ-32P)dATP(比活度>5 000Ci/mmol)、3H-TdR(比度：30Ci/mmol,浓度：1mCi/ml)分别购自北京亚辉生物工程公司和中国科学院上海核技术开发公司，CDK2、CyclinA、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、p21、p80cdc25B抗体购自Santa Cruz公司，ECL免疫印迹试剂盒购自Amersham公司，TdR和trifluoperazine(TFP)由Sigma公司提供。
2. 方法
2.1 S期HeLa细胞的制备：HeLa细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基，在37℃，5%CO2培养箱中培养。
采用TdR双阻断法获得S期细胞：细胞进入对数生长期后，更换含2.5mmol/L TdR阻断剂的培养液，于37℃，CO2培养箱中培养16h后，重新加入培养液释放细胞9h，更换含2.5mmol/L TdR阻断剂的培养液继续培养16h，用无血清培养液洗细胞3次，加入培养液再次释放，即获得S期细胞。
2.2 生长曲线测定：取对数生长期细胞，按1×104/ml的浓度接种于24孔板，在37℃，5%CO2条件下培养，每24h用血细胞计数板平行计数3孔，绘制曲线。
2.3 3H-TdR掺入：取TdR双阻断后释放不同点的对照细胞与药物处理的样品细胞，在含3H-TdR(1μCi/ml)的培养液孵育1h后，经洗脱与裂解，用GF/C型玻璃纤维素膜抽滤，烘干，液闪计数，掺入强度用cpm/106细胞表示。
2.4 胸苷激酶(TK)活性测定［1］：以2.5×107细胞/ml的浓度，用细胞抽提溶液(10mmol/L Tris-HCl,pH8.0;1.6×10-5mol/L thymidine,0.003mol/L β-mercaptoethanol)悬浮细胞，反复冻融，使细胞及细胞核完全破裂，4℃离心，取上清液15μl，加30μl反应液(15mmol/L MgCl2,30mmol/L Tris-HCl,pH7.5;30mmol/L ATP)，加10μCi3H-TdR及适量细胞抽提溶液，37℃反应20min，点样在DE81纤维素膜上，洗膜，烤干，用液体闪烁计数器测cpm值，经Bradford法测定蛋白浓度后计算每微克蛋白的酶活反应的cpm值。
2.5 Western blotting:收集细胞，离心，加入适量的细胞裂解液(10mmol/L Tris.Cl pH6.8,2.5%SDS,10% β-mercaptoethanol,1mmol/L PMSF,10%甘油)进行裂解。离心取上清作为电泳样品，Bradford法测定蛋白浓度，以血清白蛋白作为标准品。进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(laemmli系统，1000V，30mA,1h)后，电转移到硝酸纤维素膜(Amersham公司)上，电转移的条件为0.75mA/cm2。膜经封闭后分别与一抗溶液(稀释度为1000～2000倍)和辣根过氧化物酶标记的二抗溶液(稀释度为2 000倍)室温下振荡孵育，洗膜，按照ECL免疫检测试剂盒说明进行显色、曝光。
结果
1. CaM拮抗剂TFP对HeLa细胞生长的影响
HeLa细胞在含TFP(20μmol/L)的培养液中培养，测定生长曲线，结果表明HeLa细胞的生长受到抑制，在第5d是对照组的45%(图1)。
图1 TFP(20μmol/L)对HeLa细胞生长的影响
Fig.1 Effect of TFP on growth of HeLa cells
2. TFP对HeLa细胞S期进程的影响
TdR双阻断将细胞阻断在G1/S交界处，对照组细胞释放后继续培养，实验组细胞在阻断释放时加入TFP(20μmol/L)处理，上述两组细胞分别取0.上一页 [1] [2] [3] 下一页
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