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大鼠实验性胃溃疡自愈期间胰岛A细胞的结构和功能变化 |
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indings proved that the islet A cells were involved in the regulation of ulcer healing process by increasing their number and enhancing their functions of synthesizing and secreting glucagon.
【Key words】 Islet A cell; Morphometry; Ultrastructure; Glucagon; Experimental gastric ulcer; Rat
胰高血糖素能预防阿司匹林等引起的胃粘膜损伤早已有实验证明［1］。在大鼠实验性胃溃疡自愈过程中，胰岛A细胞多种酶活性增强，说明A细胞代谢活跃，可能与溃疡的修复愈合有关［2］。本实验在已有工作的基础上，对大鼠实验性胃溃疡自愈期间胰岛A细胞进行了形态计量、超微结构观察及胰高血糖素放射免疫测定，以期将形态与功能结合，进一步探讨胰岛A细胞参与溃疡自愈调节的可能途径。
材料和方法
成年雄性Wistar大鼠120只，体重180～210g，随机分为实验性胃溃疡组(溃疡组，60只)、盐水对照组(盐水组，48只)和正常对照组(正常组，12只)。大鼠实验性胃溃疡模型按本室已建立的方法［3］制作。盐水组为模拟手术，注射等量生理盐水代替冰醋酸。正常组不作任何处理。分别进行以下实验：
1. 胰岛A细胞的形态计量
1.1 免疫组织化学PAP法：分别于胃溃疡模型术后第6、10、14、21和28d取大鼠胰尾，Bouin液固定，常规石蜡包埋，制成6μm厚的连续切片，将同一时间点溃疡组、盐水组及正常组各6只大鼠胰尾相同序号的切片裱于同一张载片上。从溃疡组及盐水组各时间点和正常组胰腺切片中每例取片，隔20片取1片，按Sternberger PAP法进行免疫组织化学染色。主要步骤为：切片常规脱蜡到水，甲醇-H2O2封闭，依次滴加兔抗胰高血糖素抗血清(1∶2000 Watpa公司，新西兰)，羊抗兔IgG(1∶50)及PAP(1∶100)，DAB-H2O2液显色，Mayer苏木精复染。PBS代替胰高血糖素抗血清作为方法对照。
1.2 细胞计数方法：按体视学要求取样，从每个动物的胰腺切片中选直径100μm以上的胰岛9个，每张切片取3个在×400的放大倍数下用点测量法计数目镜测试方格内胰岛落点数(PI)及所测胰岛内胰高血糖素免疫染色细胞(A细胞)数(NX)。用下列公式计算A细胞面数密度(NA)，所得数据经t检验处理。
a，为一个测试点所代表的测试格面积。
2. A细胞超微结构观察
从溃疡组和盐水组术后第6、10、14、21和28d各时间点和正常组分别取3个大鼠的胰腺，按常规制备电镜标本和观察。
3. 胰高血糖素放射免疫测定
溃疡组和盐水组术后第4、6、10、14、21和28d大鼠(溃疡组10只/时间点，盐水组8只/时间点)和正常组大鼠(12只)禁食24h后，用3%戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉并经心脏取血。用北京海科锐生物技术中心研制的胰高血糖素放射免疫测定盒并按其说明书对血浆胰高血糖素进行放射免疫测定。取血2ml，加入盛有100μl抑肽酶1 000kIU和0.5mol/L EDTA-Na的试管内，轻轻摇匀，离心分离血浆。然后依次向放射免疫测定管中加入血浆100μl，抑肽酶50μl，胰高血糖素抗血清100μl,125I-胰高血糖素100μl，震荡混匀，4℃保温24h。之后加入免疫沉淀剂500μl，震荡混匀静置15min，2 000g离心15min，弃上清，用1470WIZARDTM自动γ计数仪得出样品的胰高血糖素浓度ng/L，所得数据用t检验处理。
结果
1. A细胞的形态及形态计量
A细胞位于胰岛周边，胞质呈棕黄色，形状不规则，呈三角形、多边形及梭形并常有突起(图1)。外分泌部亦有分布于腺泡上皮和导管上皮细胞之间的免疫染色细胞，但数目较少。在溃疡自愈期间，胰岛A细胞自溃疡后6d始明显增加，持续至溃疡后21d(图2，3)。溃疡后10d及14d，外分泌部可见散在于腺泡之间及导管周围的胰高血糖素免疫染色细胞团，尤以溃疡后14d最明显(图4)。其他时间点及正常组则未发现。
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