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生长抑素对人脐静脉张力的调节及其局部来源 |
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，特别是心脏和脑血管周围的神经纤维中，具有调节血管张力的作用［2］。
人脐血管是母体与胎儿间唯一的血液通道而且缺乏神经支配［3］。SOM是否和如何参与对人脐静脉(human umbilical vein,HUV)张力的调节以及是否存在HUV局部来源的SOM尚不清楚。本实验应用原位杂交(in situ hybridization,ISH)技术对体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)进行了研究。
材料和方法
1. 人脐静脉张力测定
参照Hansen等［4］的方法，取健康孕妇足月(胎龄为37～40周)正常分娩的新生儿新鲜脐带，立即置入4℃预冷的Krebs缓冲液中(Krebs缓冲液含NaCl119、KCl 4.6、CaCl2 1.5、NaH2PO4 1.2、MgCl2 1.2、葡萄糖11，mmol/L)，仔细分离出HUV，切成约3～5mm长的血管环。将所有血管环置入恒温37.0±0.5℃的Krebs缓冲液中，并持续通入95%O2+5%CO2,60个气泡/min，至少平衡30min后，将两个自制微型L型拉钩插入血管环的管腔内，注意避免损伤HUVEC，一端固定，另一端连接Grass Ft 03机械电换能器(英国Instrument Company Ltd)，适当调节基础张力，30min后用Beckmann R611多用途描笔(德国Heraeus公司)记录张力曲线。
首先加入终浓度为10-6mol/L的去甲肾上腺素(noradrenaline,NA)使血管环收缩并一直维持NA存在，逐渐加入终浓度分别为10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L的SOM，记录血管张力变化。用眼科镊轻轻刮拭血管腔内表面除去HUVEC后，重复上述过程。
2. HUVEC的原代培养
根据本室建立的方法［5］培养HUVEC，24h后换液，换液时进行分组，分别加或不加10-7mol/L的血管活性肠肽(vasoactive intestine polypeptide,VIP)、P物质(substance P,SP)和SOM，72h时取培养细胞用于ISH染色。
3. cRNA探针制备
参照蔡文琴等［6］叙述的方法，将含有SOM cDNA片段的psp65质粒转入大肠杆菌HB101(质粒和细菌均由第二军医大学向正华博士转赠)中，扩增抽提后用Sa1 I酶切，用地高辛(Dig)配基随机标记RNA探针法以Dig-11-UTP标记cRNA探针。探针最终工作浓度为2.5mg/L。
4. ISH染色
Dig标记的SOM cRNA探针进行体外培养HUVEC的ISH染色程度，参照蔡文琴等［6］叙述的步骤进行杂交前、杂交和杂交后处理。抗Dig抗体Fab段的最终工作浓度为1∶1000，以硝基蓝四唑(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-碱性磷酸酶(BCIP)显色系统显色(上述试剂均为Boehringer Mannheim公司产品)。实验重复3次。封片后采用白细胞分类计数方法，在显微镜下随机计数。每组观察3个标本，每个标本随机计数300～400个细胞，共计数1000个以上细胞，计算其阳性百分率。
实验对照组设置：(1)空白对照组，以不含探针的杂交液进行原位杂交，其余步骤同上；(2)RNase对照组，在杂交前处理中预先用10mg/L的RNase溶液(以标准醋酸盐溶液配制)37℃孵育15min，其余步骤同上。
5. 统计学处理
参照苑锡光编著的《医用统计分析》方法［7］，ISH染色阳性百分率应用两个总体率的假设检验方法进行比较。
结果
1. 人脐静脉张力测定
无论HUVEC存在与否，10-6mol/L的NA均可导致HUV明显收缩，在NA导致HUV收缩的基础上，加入系列浓度(10-7～10-3mol/L)SOM后观察HUV张力的变化表明，在HUVEC存在时，10-3mol/L的SOM对HUV有明显的舒张作用，在除去HUVEC后，10-3mol/L的SOM对HUV的张力几乎没有影响(图1)。当SOM的浓度低于10-3mol/L时，无论HUVEC存在与否，SOM对HUV的张力均未见明显影响。
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