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0Co辐射源(军事医学科学院二所)，Hoechst 33258为Fluka公司产品，其他化学试剂为国产分析纯。
2. 细胞培养
HL-60、K562及CEM细胞均为悬浮细胞，在RPMI1640培养基(含10%小牛血清)中、37℃、5%CO2条件下培养，3d传代1次。取对数生长期细胞用于实验。
3. γ-射线照射
照射前1d细胞换液，照射时细胞浓度为1×106/ml，HL-60细胞以5Gy γ-射线照射，剂量率1.943Gy/min，于照后继续培养9、12、24、30h;K562和CEM细胞以20Gy照射，剂量率4.087Gy/min，于照后继续培养0.5、1、1.5、2、3d。分别收获细胞用于DNA梯状带(DNA ladder)检测。以未照射常规培养细胞为阴性对照。
4. 细胞凋亡时限检测
在1×106个经PBS洗涤后的离心沉淀细胞中加入0.5ml低渗裂解液(1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris,100mmol/L NaCl,1%SDS,含100mg/L蛋白酶K)，混匀，37℃ 30min，离心沉淀(12 000rpm)；上清用酚：氯仿：异戊醇(1∶12∶1)抽提，无水乙醇和NaAc沉淀DNA，溶于Tris-EDTA(TE)缓冲液中。1%琼脂糖凝胶电泳，端电压60V，1h，紫外光下观察。以DNA梯状带出现作为细胞凋亡判断标准。取凋亡前、后细胞用于形态学观察。
5. 苏木素染色
HL-60细胞，用LTP-C型离心涂片机(北京四环科学仪器厂生产)制备单细胞涂片，常规苏木素染色，光镜观察。
6. Hoechst 33258染色
HL-60、K562及CEM细胞，分别制备单细胞涂片，甲醇：冰乙酸(3∶1)固定5min，点加Hoechst 33258染液(5mg/L)染色10min，稍洗，荧光显微镜下观察。活细胞核呈弥散均匀白色荧光，出现凋亡细胞时，细胞核或胞质内可见浓染致密的白色颗粒状荧光。
7. 透射电镜样品制备
HL-60细胞，PBS洗涤，离心入琼脂块，3%戊二醛固定2h、1%锇酸固定1h，50%～90%乙醇系列脱水，10min/次，丙酮浸透，Epon812包埋，常规制备超薄切片(Leica Company Model S),透射电镜(Philip EM-400T)观察。
结 果
1. 细胞凋亡时限
HL-60细胞于5Gy照后24h(图1)，CEM细胞于20Gy照后24h，K562细胞于20Gy照后36h出现DNA梯状带。
图1 5Gy照后不同时间HL-60细胞DNA电泳结果。a.未照射(阴性对照) b.12h c.24h d.30h e.DNA marker
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from HL-60 after 5Gy γ-irradiation at different time.a,0Gy(control); b,12h;c,24h;d,30h;e,DNA marker.
2. 苏木素染色光镜观察
早期，见HL-60细胞胞体变大，胞膜出泡，细胞核染色加深不明显。后期，在细胞之间可见着色与细胞相同或加深的大小不一的圆形凋亡小体。
3. Hoechst 33258染色荧光显微镜观察
早期，凋亡HL-60细胞膜出泡明显，细胞核荧光增强，个别细胞可见染色质边聚形成新月状。后期，大多数细胞核碎裂形成多个大小不一，染色质致密团分散于细胞内。细胞间可见许多大小不一和荧光强度不等的凋亡小体(图2)。K562和CEM细胞形态变化与HL-60稍有不同。K562细胞易见到致密染色质边聚及胞膜发泡现象，后期细胞核并无碎裂，而是形成一个致密细胞核(图3)。CEM出泡不明显，凋亡小体少见，主要是含一个致密细胞核的凋亡细胞(图4)。
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