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gadd153基因对卵巢癌细胞生长抑制作用的研究 |
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Cancer Center;3AO为卵巢上皮癌细胞株，来源于上海中国科学院细胞库。
1.2 目的基因、质粒和菌株：gadd153的目的基因、plXSN逆转录病毒表达载体、大肠杆菌DH5-α均由人民医院中心实验室王申五教授惠赠。
1.3 试剂：内切酶、T4连接酶及G418均为Sigma产品，Lipofectin (DOTAP)购自Boehringer Mann-heim公司；RNA及RT-PCR试剂盒购自同正公司。
2. 方法
2.1 质粒构建、鉴定、纯化：plXSN-neo逆转录病毒表达载体经BamH-1酶切(使其成为线性)，T4连接酶将目的基因gadd153(BamH-Ⅰ单酶切后回收)连接于plXSN-neo载体。重组质粒为plXSN-gadd153，转化大肠杆菌DH5-α，提取质粒酶切鉴定 重组，PCR鉴定方向；PEG8 000纯化。
2.2 细胞转染及筛选：采用Lipofectin(DOT-AP)方法.将plXSN-gadd153重组质粒分别转染SKOV3和3AO细胞株，5%CO2，37℃培养箱培养。而以空载体pLSXN-neo分别转染上述细胞株为阴性对照；亲本SKOV3和3AO细胞株为空白对照。
根据真核质粒有G418抗性，用G418进行筛选培养。从高浓度(600 mg/L)开始，当对照组细胞大部分死亡，G418的浓度降低一半(300 mg/L)，维持筛选，待长出单克隆后，扩大培养。
2.3 G418筛选后的细胞鉴定：根据gadd153基因全序列，设计上下游引物：S:5′-AGCTGGAAGCCTGGTATGAG-3′ SA:5′-GACCACTCTGTTT-CCGTTTC-3′ RT-PCR内参引物为(β-actin)： S：5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′ SA：5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′
提取细胞RNA，按试剂盒说明进行RT-PCR。
2.4 细胞诱导的条件：用不同浓度的足叶已甙(Vp16)诱导亲本卵巢癌细胞株SKOV3和3AO、培养不同时间，经RT-PCR测定gadd153基因的表达。
同样的条件诱导实验组、阴性对照组及空白对照组细胞，进行细胞生长抑制和凋亡指标的测定。
Vp16浓度(mg/L)：10、20、40、80、160、320、640，培养时间(h)：12、16、20、24、28、32、36优化的最佳条件：浓度(mg/L)：80、160，培养时间：24h。
2.5 细胞凋亡测定：碘化丙啶(PI)荧光染色流式细胞仪(FCM)分析细胞凋亡［1］。
DNA“ladder”测定：收集约5×106待检细胞，用细胞裂解液(1%NP40、20mmol/L EDTA pH8.0、50mmol/L Tris. HCl pH7.5)裂解，蛋白酶K消化(1g/L)，提取DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳(80V，约2～3 h)后观察结果。
结 果
1. 经Vp16诱导的卵巢癌SKOV3和3AO细胞株，RT-PCR的鉴定结果：无gadd153基因产物表达；转染外源性gadd153基因的卵巢癌细胞株SKOV3和3AO，Vp16诱导后gadd153基因表达阳性(图1)。
图1
图1 经UV诱导的SKOV3-gadd153、3AO-gadd153、SKOV3、3AO细胞RT-PCR鉴定结果。 1.SKOV3-gadd153细胞RT-PCR产物可见在1.0kb处有1条带 2.3AO-gadd153细胞RT-PCR产物可见在1.0kb处有1条带 3.SKOV3细胞RT-PCR产物未见条带 4.3AO细胞RT-PCR产物未见条带 M.PBR322／BSTN-Ⅰ marker
Fig.1 Identify of various cells by PT-PCR.1.SKOV3-gadd153 cell； 2.3AO-gadd153 cell; 3.SKOV3 cell; 4.3AO cell; M,PBR322／BSTN-1 marker.
2. 质粒pLXSN-gadd153构建结果，BamH-Ⅰ内切酶消化及PCR鉴定为正向连接(图2)。
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