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MSH27抗原在小鼠睾丸中的定位 |
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膜融合过程中发挥重要的作用。
精子在顶体完整的条件下，不暴露MSH27抗原决定簇，但我们在以往的研究中注意到，一小部分睾丸中的变态精子经过胰蛋白酶处理后呈现MSH27免疫染色阳性，因而推测MSH27抗原是由睾丸产生的。本研究通过免疫组织化学和免疫电镜的方法，观察了睾丸内精子发生过程中MSH27抗原的分布和变化。
材料和方法
1.材料
雄性昆明系小鼠，10～12周龄。
2.免疫亲和层析和电泳
断颈处死小鼠，取睾丸并去除白膜，于PBS中漂洗以除去分散的细胞，然后于预冷的匀浆器中制备睾丸匀浆。用10倍体积(含1%Triton X-100)的提取液(含5mmol/L EDTA,10mg/L aprotinin, 10mg/L leupeptin, 0.01mol/L PMSF的Tris-HCl缓冲液，pH8.0)提取蛋白30min。提取物经过(3 600×g，10min)和(100 000×g，45 min)两次离心，分别去除不溶的组织及细胞成分。上清经0.22μm孔径的滤膜过滤和普通的sepharose 4B(Pharmacia公司)预吸附。然后过单克隆抗体MSH27交联的sepharose 4B亲和柱，先后用含0.5%的脱氧胆酸钠和0.5 mol/L氯化钠的碳酸盐缓冲液(pH8.0)进行洗脱。免疫亲和层析分离的蛋白经过透析和冷冻干燥后，进行变性的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳［1］，检测单抗MSH27识别的睾丸中抗原的分子量。
3.睾丸的免疫组织化学染色
取新鲜雄性小鼠睾丸，浸于OCT(Tissue-Tek公司)中，立刻于液氮中冻结。于-27℃恒冷箱制备冰冻切片，用4%多聚甲醛固定后进行免疫染色。首先用左旋咪唑和固蓝(fast blue)处理固定后的组织，封闭内源性碱性磷酸酶。然后用10%的小牛血清封闭非特异性结合位点。在组织切片上，依次加MSH27杂交瘤细胞培养上清作一抗、羊抗鼠IgG和碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物(APAAP)，于37℃各孵育1h，每步之后均用含0.05%Tween-20的PBS冲洗3次。其后，用萘酚AS-BI磷酸酯作底物和固红(fast red)偶联显色。对照组不经过单抗MSH27孵育，其他步骤与实验组相同。最后均用Harris苏木精复染。
4.免疫电镜
用1%巴比妥钠麻醉小鼠，打开腹腔，从睾丸动脉注射预冷的PLP固定液(0.01mol/L NaIO4-0.075mol/L赖氨酸-2%多聚甲醛，pH6.2)［2］。至睾丸变白后，剪下睾丸，浸入预冷的PLP液中过夜(固定2h后去除白膜)。睾丸经预冷的PBS漂洗后，用梯度蔗糖-PBS(分别经过含量10%、15%、20%蔗糖和20%蔗糖加10%甘油)逐步浸透，每步于4℃浸泡6h。最后将睾丸转入OCT中渗透。经液氮冷冻5min后，于-20℃制冰冻切片(厚度6μm)，切片贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上。
切片经10%正常羊血清封闭后，加MSH27杂交瘤细胞培养上清孵育1h。经PBS冲洗3次后，加含1%明胶、10%正常羊血清、0.05%Tween-20和0.5mol/L NaCl的PBS(pH8.0)封闭，然后加胶体金(5nm)标记的羊抗鼠IgG(中山生物技术公司产品)孵育1h，用封闭液冲洗。最后用1%锇酸做后固定、梯度酒精脱水，Epon812包埋。超薄切片，醋酸双氧铀染色，透射电镜观察［3］。
结 果
1.单抗MSH27在睾丸中识别的抗原
由免疫亲和层析分离睾丸中的抗原，获得了分子量为126kD和116kD两种蛋白，前者较后者相对含量高(图1)。睾丸中存在的单抗MSH27的抗原和成熟精子中存在的抗原的分子量(39kD)显然不同。
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