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癫痫大鼠海马内凋亡神经元超微结构的研究 |
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雄性SD大鼠24只，体重180～250g,分为实验组(n=16)和对照组(n=8)。实验组大鼠颈部皮下注射KA(10mg/kg;5g/L)，对照组大鼠颈部皮下注射生理盐水(2ml/kg)。根据Racine［8］所描述的癫痫行为1～5级标准，观察实验组动物全部达到4级或5级后，即认为实验组动物已符合癫痫模型的要求。
对照组和实验组动物分别在给予生理盐水或KA1、3、5、7d后以水合氯醛(400mg/kg)麻醉。经心脏先以100ml生理盐水冲洗后，再用含2%多聚甲醛1.25%戊二醛的0.1mol/L的磷酸缓冲液200ml灌流固定。取脑，用与灌流液相同的固定液后固定过夜，再将其浸泡于含20%蔗糖的磷酸缓冲液中直至下沉。
2.光镜及电镜样品制备
沿大脑正中裂将鼠脑分为左、右两部分。取左侧脑组织常规脱水，石蜡包埋。石蜡切片机切取脑片，脑片厚度为10μm,硫瑾染色，光镜下观察。
取右侧脑组织用振动切片机切片，片厚为60μm。2%锇酸(pH7.4)室温下后固定1h，磷酸缓冲液洗3次，梯度酒精脱水，Epon812平板定位包埋。光学显微镜下分别选取齿状回门区和CA1区的组织，并将其粘在预制的空白包埋块上，LKB超薄切片机切片，经醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，JEM-2000EX透射电镜观察并摄片。
结 果
1.光镜结果
海马齿状回门区(图1)KA后1d，仅偶见凋亡神经元；KA后3d，可见较多的凋亡细胞；KA后5d凋亡细胞数目最多；KA后7d，该区凋亡神经元的数目已开始减少。
海马CA1区(图2)KA后1d，仅偶见凋亡神经元；KA后3、5d，凋亡神经元的数目渐次增多；KA后7d，凋亡神经元的数目达到最多，同时伴有神经元数量的明显减少。
海马齿状回门区和CA1区凋亡神经元的形态表现为胞核、胞质深染，整个神经元呈浓缩状态，体积缩小，细胞突起明显减少，甚至消失。
2.电镜结果
电镜下，KA后3、5、7d时，在海马齿状回门区和CA1区均可见到不同阶段的具有凋亡表现的神经元，其凋亡表现与注射KA的时间不同步。在齿状回门区和CA1区所见凋亡神经元的形态大致相同，许多凋亡神经元周围可见胶质细胞突起包绕。早期阶段的凋亡神经元的形态仅表现为染色质积聚成块、边集(图3)。而且经常可见集聚的染色质在核内形成不规则的染色质环，环内为电子密度低的核质及均匀分布于核质内的细小的颗粒状物(图4A)。在凋亡的晚期阶段，有时全部染色质完全聚集在一起，在核内形成一个大的高电子致密度的染色质团块。凋亡神经元的核膜常会出现皱缩、折迭和扭曲(图5A)。在凋亡的晚期阶段，核膜常出现破裂。
在凋亡的早期阶段，胞浆内的变化仅表现为部分粗面内质网略有肿胀(图3)。此时，胞浆的电子致密度较高，而多数线粒体、高尔基器等其他细胞器仍保持正常状态。在凋亡的晚期阶段，大部分的粗面内质网都出现肿胀，粗面内质网上的核糖体脱落，散在分布于胞质中。
在部分凋亡的神经元胞体内，有时可见一些成束状的微丝样结构(图4B)。这些“微丝束”既可见于胞浆内的细胞器之间，又可见于核内边集的成块的染色质之间。此外，在凋亡神经元的胞体或突起与其邻近结构之间，有时可见到一些突触样结构(图5B)。
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