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集落刺激因子 |
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ysine包被的玻片。细胞密度为5×105／盘，培养液为无血清DMEM或Honegger培养液。培养神经元的鉴定见下(4.4)
4. 免疫细胞化学
4.1 实验组：无血清脑皮层神经元培养5d后，将载有培养细胞的玻片，用冷Dulbecco生理平衡液(DPBS)冲洗后移入预冷(-20℃)甲醇固定10min,DPBS冲洗，然后用含有2%无脂奶粉的DPBS温育20min，以消除非特异性染色。第一抗体为1∶200稀释的兔抗c-fms抗体，4℃孵育过夜。第二抗体为生物素标记的抗兔IgG抗体(1∶500,Vector)，室温30～45min。然后在卵白素-生物素-辣根过氧化物酶复合物(1∶100，Vector)中室温1h。上述各步骤间，均经含2%无脂奶粉的DPBS充分冲洗。呈色反应液为含0.1%H2O2，0.05%DAB，1.5%NiSO4的醋酸缓冲液(pH6.0)，室温下显色1min。显色后经脱水，封片。
4.2 对照1：替代实验。用未经免疫的兔正常血清替代第一抗体(抗c-fms)孵育，其他处理同实验组。
4.3 对照2：吸收试验。分别用表达CSF-受体(c-fms)的小鼠巨噬细胞系5／10.14和不表达CSF受体(c-fms)EL4鼠淋巴瘤细胞与抗c-fms抗血清在37℃共孵育30min后离心，取上清液代替第一抗体进行免疫组织化学染色，其他处理同实验组。
4.4 对照3：双标记实验，以确定所标记细胞是否为神经元。用抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)的单克隆小鼠抗体(耶鲁大学D.J.Barnstable,惠赠)1∶200稀释与抗c-fms多克隆兔抗体共孵育同一载有培养细胞的玻片，4℃孵育过夜。选用罗达明标记驴抗鼠IgG(Jackson Research Laboratory)和FITC标记的驴抗兔IgG(Jackson Research Laboratory)作为标记抗体稀释度均为1∶100，室温孵育1h。充分漂洗后用甘油：DBPS(1∶1)封片。Zeiss荧光显微镜观察、摄片。
5.分子原位杂交组织化学
5.1 实验组：将携有培养细胞的玻片，移入0.03mol/L PBS漂洗后(用DEPC处理过的双蒸水配制)，迅速换入含4%多聚甲醛，5%冰醋酸的磷酸缓冲液中室温下固定细胞30min。0.03mol/L PBS充分漂洗(30min×2)，入70%酒精4℃下保存。杂交前，经5×SSC漂洗后移入杂交缓冲液。其液含50%甲酰胺，4×SSC，1×Denhart溶液1%十二烷基肌氨酸钠，0.02mol/L PB(pH7.0)，10%硫酸葡聚糖，0.5g/L热变性鱼精子DNA，0.2mol/L二硫苏糖醇以及0.002μg/L地高辛标记探针。在湿盒中42℃孵育16～18h后，在1×SSC中，于55℃洗4次，每次15min。然后用1∶2 000稀释的碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(Boehringer Mannheim)孵育，室温下1h。漂洗后入含NBT，X-phosphate(Boehringer Mannheim)的Tris缓冲液显色。DPBS冲洗 以中止反应。甘油：DPBS(1∶1)封片。
5.2 对照试验：在杂交液中加入过量(800倍于标记探针)的未标记的同源冷探针或过量的具有相同长度和相似C-G含量比的未标记的无关探针行杂交反应，其他处理同实验组。
结 果
1.免疫组织化学组
用3种针对CSF-1受体(c-fms)分子不同部分的抗体作免疫细胞染色，尽管免疫反应强度有所区别，但几乎所有细胞均显示免疫染色阳性(图1)。抗体吸收和替代实验的结果为用相关细胞系(携CSF-1受体的鼠巨噬细胞系5／10.14)吸收过的抗血清作免疫染色结果阴性(图2)；用无关细胞系(不具有CSF-1受体的鼠淋巴细胞瘤EL4细胞)吸收过的抗血清作免疫染色，尽管染色强度较实验组略弱，但仍为阳性(图3)；用非免疫同源兔血清替代实验用抗血清进行免疫染色，结果阴性。应用c-fms与NSE免疫双标记方法显示，所有标记细胞均为双重染色的双标记细胞。说明阳性细胞确系神经元(图4，5)。
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