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大鼠脑垂体前叶内IL |
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一是具有神经营养效能［4］。本实验观察双侧肾上腺切除后大鼠垂体前叶IL-6免疫阳性物质的表达变化，为应激时垂体内神经纤维可塑性的发生机制提供线索。
材料和方法
1.动物及分组
成年雄性大鼠24只，体重200～250g，随机分为正常对照组和双侧肾上腺切除组。每组12只。
2. 动物手术及固定、切片
2.1 肾上腺切除术：将大鼠用戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(40mg/kg)，俯卧于手术台上，固定其四肢和头部，鼠尾朝向手术者。从背部正中、胸廓下缘高度切开皮肤，约长1.5cm。分离皮下组织，用组织钳牵开皮肤，暴露腹后壁肌肉，在肋脊角处剪开一小口，暴露肾上腺，将其游离、摘除后缝合肌层。再以同样步骤摘除另一侧肾上腺，缝合皮肤。大鼠存活4d。手术组动物给予饮用生理盐水。正常对照组动物从动物中心领回后在安静环境中饲养1周，然后直接取材。24只大鼠分3批进行灌注固定，每批8只，其中正常对照组4只，肾上腺切除组4只。
2.2 材料处理：动物在戍巴比妥钠腹腔麻醉下开胸，经左心室插管至升主动脉。先灌流100ml生理盐水以冲洗血液，随后用4℃的4%多聚甲醛磷酸缓冲液(PB)500ml灌注，先快后慢，维持约1h。取出垂体，浸入20%蔗糖PB液中，置4℃冰箱过夜。用恒冷箱切片机作冰冻连续切片(16只作矢状面切片，8只作冠状面切片)，片厚约15μm。收集全部切片。
3. 免疫组织化学程序
3.1 将切好的恒冷箱切片置室温下晾干，约30min。切片然后经充分漂洗后，浸入0.3%甲醇-双氧水中，室温30min(每100ml甲醇-双氧水液中含80ml甲醇，20mlKPBS和30%H2O21ml)。经KPBS漂洗后，切片浸入含0.3%Triton X-100的KPBS(0.01mol/L,pH7.4)中。室温30min，入IL-6单抗(本实验用了两种IL-6单抗，一种由北京军事医学科学院沈倍奋教授惠赠，1∶1 000；另一种是本校免疫教研室制作，1∶300，两种抗体所作的结果一致)，在室温下孵育24h。两种抗体的特异性检测已有报道［5，6］。经一抗后，用0.01mol/L KPBS液漂洗数次，约30min。将切片置于结合了生物素的抗小鼠IgG(Sigma公司，1∶500)中室温孵育3h，经KPBS充分漂洗后，再置入ABC复合物(Sigma公司，1∶500)中，室温下孵育3h，充分漂洗后，用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵方法［7］显色。
3.2 阳性对照：用血清稀释液替代一抗，其余反应步骤同上。未见垂体前叶有阳性反应结果。
4. 计算机辅助图像分析
用Leica Quantimet570图像分析仪进行垂体切片阳性面积检测，正常对照组和手术组各取6套免疫组织化学染色好的切片进行图像分析。从每套切片中依次间隔抽取垂体切片10张，每张切片随机选取2个视野，结果以灰度值表明，灰度分为0～255，共256级。根据染色强度深浅情况，我们选定灰度值90以上的染色作为阳性进行分析。测量每个视野内免疫阳性反应的面积值，每个视野框的面积为62 683.5μm2。计算每套切片中20个视野中每视野的阳性面积平均值，并计算每组的均值。用t检验检测两组动物IL-6免疫反应产物数量间有无差异性。
结 果
正常对照组的垂体前叶内有IL-6样免疫阳性产物存在，多定位在血管内皮细胞内，少数在滤泡星形细胞(FS)。在正常动物FS阳性细胞数量较少(图1)，分布弥散，染色浅淡，其形状呈圆形或椭圆形，无突起或突起短(图3)。在肾上腺切除组的垂体前叶，IL-6阳性的FS细胞较正常对照组数量明显增多(图2)，胞浆染色加深，细胞增大，突起增多、变长(图4)，形状多为梭形、三角形、卵圆形、多边形，形态多样。从整个垂体前叶来看，呈散在分布，但双侧肾上腺切除后，IL-6阳性细胞相对较多地分布在垂体前叶背侧近垂体裂处及前叶的两翼中部靠腹侧处，这与SP免疫阳性神经纤维分布区相似［8］。图像分析结果表明，6例正常动物中，每例的垂体前叶10张切片中所选取的20个视野的阳性面积的每视野平均值分别为1940.8、2051.5、2404.1、3094.2、2720.9、3002.9，6例平均为2525.7。而肾上腺切除组的6例动物中，每例的垂体前叶10张切片中所选取的20个视野的阳性面积的每视野平均值分别为4096.9、3829.6、3495.2、4093.3、3895.2、4006.9，6例平均为3 902.8。比较两组动物阳性面积的大小，相差显著，肾上腺切除组约为正常组的1.5倍(P＜0.05)。
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