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脑啡肽对早期反应性胶质增生形态及其神经营养功能的影响 |
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标观察脑啡肽对反应性胶质细胞神经营养功能的影响。
胶质细胞是中枢神经系统中NO的主要来源之一［3］，NO的过量表达能通过多种机制造成组织、细胞的损伤，并有报道ME可抑制NO的跨膜释放［4］。为此，本实验进一步观察了ME对反应性胶质细胞生成NO的影响，以期探讨ME影响反应性胶质细胞神经营养作用的机理。
材料和方法
1.中枢胶质细胞体外培养及划痕损伤
取P2d SD大鼠，无菌条件下剪取皮层，用0.25%的胰蛋白酶制备细胞悬液，以2×105/cm2密度接种于培养板内，在5%CO2、95%空气的CO2培养箱内37℃孵育。培养约1周后采用Yu［5］的方法，用消毒移液器头(200μl)，在每一培养孔内做“#”字形划痕，更换培养液以除去脱落细胞及碎片，加入新鲜培养液继续培养。
2. 反应性胶质细胞-神经元复合培养
取E16d SD大鼠，无菌条件下剪取皮层，用0.25%的胰蛋白酶制备细胞悬液，以2×104/cm2的密度种植于用多聚赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)处理的盖玻片上，置5% CO2、95%空气的培养箱内孵育。按此密度种植的神经元多呈分散生长。神经元特异性烯醇化酶(neuronal specific elonase,NSE)免疫组织化学证实，4d内神经元的纯度在90%以上。按方法1培养胶质细胞5d，划痕损伤2d后，加入按此方法制备的胚胎脑细胞悬液。
3. 3H-TdR掺入实验
用12孔培养板培养新生大鼠大脑皮层胶质细胞，7d后做划痕损伤，分为生理盐水对照组、ME终浓度分别为10-10、10-8、10-6 mol/L组及终浓度分别为10-8、10-6mol/L的ME(Peninsula,USA)+纳洛酮(naloxone,Nal；Sig,USA)组，同时加入终浓度为0.5mCi/L的3H-TdR，继续培养。24h后吸去培养液，用0.1mol/L NaOH溶液裂解细胞，将裂解液移至玻璃纤维滤膜上，置滤膜于加有5ml闪烁液(0.035%POPOP、0.45% PPO溶于二甲苯)的闪烁杯内，室温放置30min，在液闪计数仪上读取cpm值。
4.GAP-43mRNA原位杂交
新生大鼠大脑皮层胶质细胞培养5d后划痕损伤，分为ME组(终浓度10-10mol/L)和生理盐水组。培养2d后吸除培养液，用新鲜培养液清洗细胞2遍，加入取自E16d大鼠的大脑皮层细胞进行反应性胶质细胞-神经元复合培养。2d后取出培养片用Dig标记RNA探针(第三军医大学组织学胚胎学教研室合成)做GAP-43mRNA原位杂交。方法简述如下：4%多聚甲醛固定5min，蛋白酶K(2mg/L)37℃消化2min，滴加含GAP-43mRNA探针(10g/L)的杂交液，37℃杂交2h,DIG免疫组织化学，NBT、BCIP显色。替代对照：用不含探针的杂交液行同步杂交。阳性对照：用已确认阳性的标本行同步杂交。摄片、图像处理，用Q570图像处理系统(Leica,Germany)测量单个阳性细胞的积分光密度(IA)。
5.NO测定(亚硝酸盐重氮化反应法)
新生大鼠大脑皮层细胞培养7d划痕损伤后，分生理盐水对照组、终浓度分别为10-12、10-10、10-8、10-6mol/L的ME组、终浓度分别为10-10、10-8mol/L的ME+Na1组，继续培养18h后吸取培养上清液，同时培养细胞用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，用血球计数板计数每组培养中细胞数目。化学性质极为活跃的NO，释放后很快转变为性质稳定的NO-2，可测定培养上清液中NO-2的含量，间接反映反应性胶质细胞NO生成量。在酸性环境下NO-2与对氨基苯磺酸起加成反应，其加成产物与N-(1-萘)-乙二氨发生反应(Griess重氮化反应)，反应产物在548nm处有吸收峰，具体测量方法如下：用96孔酶标板，每样品分两孔，每孔加0.15ml培养上清液后分别加入等体积的Griess液［5%磺胺溶于5%磷酸，0.1%N-(1-萘)-乙二氨，临用前1∶1混匀］或等体积的蒸馏水打匀，548nm波长下在酶标仪(BIORAD，USA)上读取吸光度，同时用不同浓度的NaNO2制作标准曲线，将样品的吸光度转换成NO-2的浓度，样品的NO-2的含量用nmol/106细胞表示。
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