|
中国人2型糖尿病的基因分型和定位 |
| |
betes mellitus; Genome－wide scanning technique; Genotyping; Gene－localization
2型糖尿病是一种多基因复杂疾病，由于受遗传和环境因素的影响，具有很强的异质性，使其基因定位变得复杂和困难，我国在这一领域的工作尚属空白。本文报告对我国NIDDM家系进行基因分型和基因定位的初步结果。
材料和方法
1. NIDDM家系样本的采集
依据以下标准，在北京协和医院内分泌科糖尿病数据资料库中选择合适的家系：(1)具有2代或2代以上能提供遗传信息的家系，每代至少有1个NIDDM患者；(2)不合并高血压、冠心病等重要脏器疾病；(3)尽量采集父母一方患病而另一方正常的家系，以减少由双系遗传(bilineal inheritance)产生的背景噪声对分析结果的影响。除了临床上正在接受治疗的患者外，家系中的所有成员均须行口服葡萄糖耐量(oral glucose tolerance test,OGTT)实验。即抽取空腹及口服75g葡萄糖(5min内喝完)后30min、60min、120min及180min的静脉血，以观察血糖浓度的动态变化。糠尿病的诊断按照WHO于1985年颁发的标准进行。即：空腹血葡萄糖浓度≥7.8mmol/L或餐后2h血糖≥11.1mmol/L者为糖尿病。OGTT的判断标准为：服糖后2h血葡萄糖浓度＜7.8mmol/L为正常，≥11.1mmol/L为糖尿病，在7.8～11.1mmol/L之间为糖耐量低减(impaired glucose tolerance,IGT)。
2. 基因组DNA提取
基因组DNA提取采用酚/氯仿抽提法。每10ml静脉血约可获得DNA250～500μg。所得DNA经酶切后用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定，确认无RNA污染，DNA分子量完整。A260/A280比值均在1.8～1.9。
3. NIDDM家系微卫星标志的基因分型
3.1 荧光标记引物：美国PE公司产品。共358对(linkage mapping set version 1)。平均杂合度在0.65以上。分布于1～22号染色体及X染色体。按照引物特性及扩增片段的大小，将358对引物分成28组。在每对引物的正义链末端(5′端)标记荧光染料，如6－FAM、HEX或TET。通过激光扫描，三者分别显示蓝、黄或绿色。
3.2 多重PCR(multiple PCR)反应：在96孔微量反应板中进行。PCR反应时，根据引物多少、颜色、产物长度等将每组引物分1次或2、3次扩增。基因组DNA50ng，Taq聚合酶0.25U，Mg2+浓度3.0mmol/L,总反应体积5μl。在PCR反应时加入抗Taq酶抗体，以保证Taq酶在一定温度下起作用，减少非特异性反应。用touch－down PCR优化最佳反应条件(退火温度)。
3.3 聚丙烯酰胺凝胶电脉(PAGE)：将稀释后的PCR产物与含有甲酰胺的(Genescan－500TAMRA(荧光扫描呈红色)内部分子量标准按一定比例混合，94℃变性3min，在ABI373或ABI 377自动测序仪6%的PAGE中电泳2～4h。应用377收集软件进行电泳图像扫描及信息收集。不同荧光标记的PCR产物或同种荧光标记，但扩增片段相差50bp以上的PCR产物可以混合在同一个泳道上进行电泳。一块胶可以同时分析6～14个微卫星标记。
3.4 基因型分析：应用GenescanTM 3.0软件分析收集到的信息。之后，再应用GenotypeTM(2.1)软件分析每个家系成员在某一微卫星标记位点的基因型。所有数据通过数字表格的形式显示并贮于Excel系统中。
结果和讨论
全基因组扫描结果表明：在35个家系中共有193个微卫星标志能准确地进行基因分型，共获得41 495个基因型(表1)。每一位点以单独的Excel表格形式显示(表2)。
表1 全基因组扫描所得微卫星位点
Table 1 Microsatellite sites obtained by the genome-wide scanning
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 1996年我国交通状况与车祸的典则相关分析
下一个医学论文： 脑啡肽对早期反应性胶质增生形态及其神经营养功能的影响
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文