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猪感染流行性出血热病毒的流行病学与实验研究 |
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取感染鼠脑无菌研磨，用细胞生长液制成10%悬液，冻融3次后，2 000转/分 20分钟，取上清液，调pH7.2～7.6，-30℃冰箱冷冻后，移放液氮罐内备用。并以同法制备正常鼠脑悬液作对照。
3.动物分组与感染方式：依动物体重从小到大编号，采用随机数字表法分4组，每组3只动物，分别皮下、口腔和肺内等3种部位注射鼠脑悬液(接种前先将口腔粘膜擦伤)，每只接种1.5ml，对照组注射等量正常鼠脑悬液，隔离饲养，并定期测定体温和观察动物的变化。
4.病毒定位与排毒途径：仔猪人工感染后，定期采血，收集新鲜尿、粪、唾液，观察EHFV抗原与抗体消长。定期宰杀取各种组织检查病毒分布和病理变化。
四、检测方法：
1.EHFV抗原与抗体检测：采用RPHA和RPHI或HRP-SPA法，组织EHFV抗原检测用IFA法。成套试剂和兔抗EHFV血清购于南京军区军事医学研究所，抗兔IgG荧光抗体由浙江省玉环生物试剂厂生产。同时用PCR技术［2］检测EHFV-RNA。
2.病毒分离：取PCR检测EHFV抗原阳性标本制成无菌滤液，分别接种乳鼠脑和Vero-E6细胞分离病毒和ID50定量测定，其操作见文献［3］。
3.动物试验：取EHFV抗原阳性血、尿、粪和肺组织制成无菌滤液分别接种乳鼠，每份各6～8只，每只腹腔注射0.2ml或脑内注射0.02ml，乳鼠由母鼠哺养，二周剖取鼠脑或肺检查EHFV抗原。
结 果
一、猪各种标本EHFV抗原阳性率：从10种标本中检出EHFV抗原，其荧光强度均在“”以上，经双盲法检测结果一致(附表)。IFA检出心、肺、肝、脾和肾EHFV抗原阳性者再用PCR检查均检出EHFV-RNA，并分离到病毒。
二、EHFV分离和ID50测定：心、肺、肝、脾、肾、血、尿、粪等各3份制成无菌滤液和10-1～10-5不同稀释度滤液分别接种乳鼠和Vero-E6细胞，传4代后，除粪标本因污染丢弃外，其余均分离到EHFV。定量测定结果见附表。
附表 各种标本EHFV抗原、抗体检测及EHFV分离结果
标本名称 检测份数 EHFV抗原
阳性数 EHFV抗体
阳性数 EHFV分离
份数 EHFV分离
株数 EHFV ID50
定量测定
心 120 4 - 3 1 10-2
肺 530 22 11 3 2 10-5
肝 120 5 - 3 1 10-3
脾 120 6 - 3 1 10-4
肾 120 5 - 3 2 10-4
血液 245 9 14 3 2 10-5
尿液 199 14 7 3 1 10-2
粪便 199 5 3 3 - -
唾液 5 2 2 - - -
圈内污物 54 3 0 - - -
三、孕猪及乳猪抗原阳性率：从一头孕猪血清及所产7只乳猪血清、尿、粪、唾液均检出EHFV抗原。乳猪上述标本抗原阳性率分别为100%、28.57%、4.19%和14.29%，并从乳猪脾、肺、肾和脑组织检出EHFV抗原。
四、人工感染：
1.临床表现和病理学检查：接种仔猪全部感染成功。其感染后体温仅个别达40.3℃(1～2天)。感染第6天始仔猪食欲减退，喜卧，活动减少。尿蛋白阴性。肺毛细血管轻度扩张淤血，间质水肿，少数肺泡内有出血；肾小球毛细血管可见淤血，内皮细胞肿胀，肾小管水肿；肝细胞呈水样变性及气球样变性，部分区域有出血；脾脏及大血管未见明显异常。对照组各种组织正常。
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