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苏芸金芽孢杆菌的肠毒素及其编码基因的研究 |
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。与其相反，蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus,简称Bc)却是人类的条件致病菌，它可引起败血症、心内膜炎等非肠道感染〔1〕，但Bc对人类健康的主要威胁是造成食物中毒，Bc所造成的腹泻型食物中毒是由其营养生长期产生的肠毒素所造成的。已阐明其结构的肠毒素有两种：一种是有三个亚基组成的具溶血活性的肠毒素，即溶血素BL(hemolysin BL),另一种是仅由一个亚基组成的肠毒素T(entertoxin T)。溶血素BL三个亚基的编码基因hblA、hblC、hblD已被克隆和测序〔2，3〕,日本学者Agata对肠毒素T的编码基因bceT也进行了克隆和测序。
尽管Bt与Bc已被界定为不同的种，但新近的文献资料表明，Bt与Bc的基因型及表现型非常相似。Carlson 1993年利用脉冲电场电泳(PFGE)及多位点酶电泳(MEE)对Bt与Bc染色体物理图谱及多位点酶进行了对比研究。结果表明，二者无实质性差异，并主张将Bt与Bc鉴定为同一个种〔4〕。尤为引人注意的是，该文作者利用免疫试剂盒所检测的12株Bt菌株中，有9株含有与Bc相似的肠毒素。1995年Damgaard的研究结果表明，用作杀虫剂的Bt生产用菌株也可产生与Bc相似的肠毒素〔5〕。上述研究结果使人们开始关注是否Bt也可造成食物中毒？尽管文献中仅有一例由Bt造成的人角膜溃疡的报道〔6〕，但对于Bt对环境影响的研究变得日益迫切。为了认识Bt对人类及高等动物潜在的致病性，最直接的办法是检测Bt种群中不同亚种所含的肠毒素及其编码基因。目前还没有全面系统的相关报道，本研究首次全面系统地对Bt种群中肠毒素及其基因的分布进行了检测，并对Bt不同品系作为杀虫剂的安全因素作出初步评价。
材料与方法
1.菌株的分离纯化及H型鉴定：
本实验使用的45个Bt标准株引自法国巴斯德研究所，15个Bt生产用菌株及野生株的分离纯化、H型鉴定按常规进行。产肠毒素的阳性参照菌株Bacillus cereus 9633由中科院微生物所蔡妙英研究员惠赠。
2.肠毒素基因的PCR检测
(1)引物：hblA基因169-1126nt区段的上游引物为5ACGAACAATGGAGATACGGC3，下游引物为5ATTTTTGTGGAGTAACAGTTTCTAC3。bceT基因188-595nt区段的上游引物为5TTACATTACC
AGGACGTGCTT3，下游引物为5 TGTTTGTGATTGTAATTCAGG3。上述两对引物参照文献〔7〕。由中科院微生物学研究所合成。
(2)模板的制备：将活化的Bt菌种接种于2YT平板，30℃培养至对数期，取一环(直径为1.5mm)菌苔,置于含100μl无离子水的Eppendorf管中，用混匀器混匀。100℃沸水浴10分钟，迅速冷却，10000r/min离心10分钟，将上清转移到一个新管。-20℃保存备用。
(3)PCR体系：供试的PCR试剂皆购于华美公司，PCR体系总体积为50μl:包括10×buffer,5μl;4×dNTPs 4μl;Taq DNA聚合酶1μl(约1U)；上述两对引物，4×1μl,模板36μl,覆盖两滴石蜡油，负对照体系不加模板，以无离子水代替。
(4)PCR扩增条件：FTS-320热循环仪(Corbert Research,Australia),供试样品在94℃变性3分钟，然后进行30个循环：94℃变性40秒，55℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，最后72℃延伸10分钟。
(5)电泳检测扩增产物：取20μl PCR扩增产物与Loading buffer(0.25%溴酚蓝，40％蔗糖水溶液)混合上样，用0.8%琼脂糖(含溴化乙锭0.5μg/ml)凝胶电泳进行检测。电泳缓冲液为0.5×TBE。电压恒定于60V电泳120分钟。紫外灯下观察、照相。
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