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RAPD分析在Hp菌株鉴定中的应用 |
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clusions PCR based RAPD fingerprinting which only needs a single primer is a rapid, simple and reproducible method in distinguishing different H.pylori strains, especially in distinguishing recrudecence from reinfection of H.pylori.
【Subject words】 Helicobacter pylori Random amplified polymorphic DNA
幽门螺杆菌(Helicobacteer pylori,Hp)感染在人群中广泛存在,被认为是慢性B型胃炎,十二指肠溃疡及胃癌的致病因素,这种Hp感染后极为不同的临床病理转归可能是存在着致病力不同的Hp〔1〕。因此,需要一种稳定、敏感的区分不同Hp菌株的方法将不同来源或致病力不同的Hp菌株区分开来。本研究采用随机引物PCR(arbitrary primer PCR,AP PCR)或随机扩增的多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)分析方法,鉴别不同来源的Hp菌株,并评价它在区分Hp根除后复发和再感染中的应用价值。
材料与方法
1.菌株来源及培养: -70℃保存的标准菌株NCTC11637,50株临床分离鉴定的菌株来自胃、十二指肠疾病行胃镜检查的病人,4例来自十二指肠球部溃疡伴Hp感染三联治疗前及治疗后1年再现的菌株。Hp菌株以抽气-换气法微需氧条件培养3～4天,观察细菌形态并以尿素酶、过氧化氢酶、氧化酶试验进行菌株鉴定。
2.DNA准备: 收集纯培养3～4天的Hp于500μl TE(pH8.0)中,以10mg/ml溶菌酶,37℃消化1小时,加10％ SDS 60μl和20mg/ml蛋白酶K 6μl,RNase终浓度20μg/ml,混匀,55℃保温2小时,以等体积的苯酚-氯仿-异戊醇及氯仿各抽提一次,加1/10体积3mmol/L醋酸钠,以无水乙醇沉积DNA,DNA溶于50～100μl双蒸水中,-20℃保存备用。
3.RAPD分析
(1)随机引物序列: 3 -CCGCAGCCAA-5 ,(北京赛百盛生物工程公司合成纯化)。所选引物是参照文献〔2〕设计的随机引物,而非Hp特异引物。
(2)25μl PCR体系：含 Hp基因组DNA 1μl(10～20ng), 3mmol/L MgCl2,20pmol引物,1U Taq DNA聚合酶(中科院遗传所); 均为250μmol/L的dCTP、dGTP、dATP、dTTP(Boehinger公司),10mmol/L Tris-HCl (pH8.3),50mmol/L KCl及0.001%明胶, 以NCTC11637 DNA作阳性对照, 双蒸水空白作阴性对照。
(3)反应条件: 先以94℃ 5分钟，36℃ 5分钟，72℃ 5分钟, 4个循环; 而后94℃ 1分钟，36℃ 1分钟，72℃ 2分钟, 30个循环; 最后72℃ 10分钟,1个循环(PE公司480 Thermal cycler进行PCR循环)。
(4)指纹分析: 20μl PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳,紫外光下照相,比较不同菌株的指纹图谱,将同一菌株不同时间的PCR扩增结果及同一病人治疗前后菌株PCR扩增结果在同一次电泳中相邻的孔中比较。
结 果
1.RAPD分析的可重复性:同一病人来源的临床分离菌株,于不同时间进行的2次PCR扩增,所得的RAPD指纹图谱完全一致,具有良好的可重复性。
2.RAPD分析的高分辨性: 50株不同病人来源的临床分离菌株各产生完全不同的RAPD图谱,可按此图谱的不同将它们逐一区分开来(图1)。
图1 部分菌株的RAPD指纹图谱
Fig1. RAPD fingerprinting of some strains
M: DNA molecular marker(100bp DNA ladder);
1-16:Different Hp strains
3.RAPD分析对复发和再感染的鉴别: 对4例十二指肠溃疡伴Hp感染三联治疗前及治疗后1年再现菌株的R上一页 [1] [2] [3] 下一页
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