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人巨细胞病毒单克隆抗体识别的抗原表位的筛选 |
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的同时也得到了它的基因；靶蛋白及其相关基因能富集并放大培养；噬菌体结构简单，易于繁殖，操作方便。
材料与方法
1.HCMV McAb 2E5纯化和标记：此单抗是中和抗体〔2〕，单抗腹水由预防医学院病毒所提供，过Protein A亲和层析柱，纯化的抗体标记生物素。
2.随机六肽文库呈现在fd噬菌体表面蛋白Ⅲ上：文库由新加坡国立大学姚志建教授提供，宿主菌K91Kan。
3.单抗筛选噬菌体随机六肽文库：具体方法参见参考文献〔3,4〕。每孔1μg链亲和素(Biolabs)包被酶联板，用3% BSA(华美)封闭，每孔加入1μg生物素化单抗(本室制备)，加10μl肽库，洗去未结合的噬菌体，然后用酸洗脱结合的噬菌体并扩大培养得到次级库，用于下一轮筛选，如此反复三轮。
4.夹心ELISA法检查富集效果：所用试剂同上。 链亲和素包被酶联板，加入生物素化单抗，加各级肽库，加酶标抗噬菌体抗体（本院五所制备），底物显色。
5.DNA序列测定：第三轮洗脱下来的噬菌体感染宿主菌，铺平板，随机挑取16个单克隆，扩大培养，收集纯化噬菌体，提取单链DNA作为模板测序。
6.序列同源性分析：由DNA序列推出氨基酸序列，通过电子邮件经互联网络送往EMBL(欧洲分子生物学库)进行同源性分析。
7.利用计算机软件对HCMV UL01蛋白进行分析：通过远程登陆在瑞士蛋白数据库中调出HCMV UL01的氨基酸序列，用PCGENE软件对此蛋白进行结构分析。
结 果
1.肽库筛选：共进行了三轮筛选，条件均有变化，得到一级库、二级库和三级库。对每一轮的产出率进行了比较(表1)，后两轮的产出率高于第一轮，说明了筛选的富集效果。
表1 每一轮筛选产出率
Table1. Yield of each round panning
Round 1 2 3
Eluate 104 105 105
Yield* 10-6 10-5 10-5
*：Yield=Eluate/Adding(1010)
2.夹心ELISA实验结果(表2)：结果显示二级库和三级库之间的差别很小，与一级库相比有明显的提高，进一步验证了富集效果。
表2 夹心ELISA实验结果
Table2. The results of sandwich ELISA
First Second Third Primary*
0.32 0.44 0.46 0
A value
0.31 0.42 0.48 0
*：The primary is the negative control
3.序列测定和分析：从三级库中挑取16个单克隆测定其所携带的外源DNA的序列，15个克隆的序列是相同的，5 -AGT GCT GGT TGG GCT TCT-3 ，对应的氨基酸序列为-Ser Ala Gly Trp Ala Ser-,外源序列的一致性很好。
4.序列同源性分析：在EMBL查询的结果显示-SAGWAS-与HCMV病毒膜糖蛋白UL01有78.8%的同源性，其中有四个氨基酸残基(AGWA)是完全相符的。
5.利用计算机软件对HCMV UL01蛋白进行分析∶
(1) HCMV UL01 的氨基酸序列∶
MGMQCNTKLL LPVALIPVVI ILIGTLVPIL LHE QKKAFYW
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