|
牛轮状病毒受体分析 |
| |
材料与方法
1.细胞培养和病毒滴定：MA104株猴肾上皮细胞培养用RPMI 1640培养基(GIBCO)加15%胎牛血清，培养液常规加双抗，于100ml培养瓶使接种细胞在37℃长成单层，用0.02%EDTA分散后，以3×105细胞/ml接种于24孔培养板，待细胞长成单层，换维持液(含1%血清)。病毒致半数细胞培养感染剂量(TCID50)按常规方法，以每稀释度病毒感染孔(4孔)半数出现细胞病变(CPE++)为准。
2.抗体和受体：BRV受体McAb及纯化BRV受体均为本室制备。杂交瘤细胞株5G10B11〔2〕利用具细胞保护作用的BRV受体McAb经免疫亲和层析法从MA104细胞胞膜中提纯BRV受体。羊抗鼠酶标IgG为军事医学科学院微生物流行病研究所产品。
3.固相分析试验：参阅文献〔3〕。受体经0.01mol/L TBS(10mmol/L Tirs-HCl,150mmol/L NaCl,pH8.4)稀释，包被于酶标板，解离的病毒以无血清1640培养基稀释至病毒液为中性，于MA104细胞24孔单层培养物进行微量滴定。
4.温度敏感性试验：分别于5支Eppendorff管中加入50μl纯化受体溶液，4支分别于4℃、18℃、37℃、60℃保温2小时，另一支于100℃水浴1分钟，0.01mol/L TBS稀释后进行常规间接ELISA实验及固相分析实验。
5.SDS-PAGE：参阅文献〔4〕。采用laemmli缓冲系统，分离胶浓度为4%～22%，堆积胶浓度为4%，电泳在2000伏小时以上。按文献〔4〕方法计算分子量。
6.蛋白酶敏感性试验：受体以400μg/ml胰蛋白酶或Pronase E蛋白酶于37℃作用1小时，然后将样品进行SDS-PAGE分析。
7.神经氨酸酶影响BRV受体生物学活性试验：受体包被于酶标板，过夜。洗涤后向包被孔中分别加入1U/ml(0.2mg/ml)Clostridium perfringens及Arthrobacter ureafaciens神经氨酸酶，0.1ml/孔，于37℃作用2.5小时。以0.2mg/ml BSA进行同样操作作为对照。以下试验步骤同固相分析试验。
8.气管粘膜组织的BRV受体分布试验：新鲜新生牛气管粘膜组织20例，用OCT包埋，于液氮速冻。免疫组化方法为ABC法〔5〕，试剂盒为美国Vector Laboratories产品。阳性对照为新生牛小肠粘膜，空白对照为0.05mol/L TBS代替I抗进行同步染色。
结 果
1.物理特性：BRV受体抗原温度敏感性试验结果见图1，在4℃及37℃之间抗原性变化不大，在60℃、100℃时，其抗原性有一定改变。图2显示受体生物学活性温度敏感性试验结果，经固相分析检测表明受体结合BRV的生物学活性受温度影响大，在60℃时完全丧失。
图1 纯化受体抗原性温度敏感性
Fig1. The temperature sensitivity of the antigenity of the purified receptor
图2 纯化受体生物学活性的温度敏感性
Fig2. The temperature sensitivity of the biological activity of the purified receptor
2.化学特性
(1)受体分子量测定：结果见图3。经计算受体分子量为48000。
图3 SDS-PAGE测定纯化受体分子量
Fig3. Molecular weight of the purified receptor detected on SDS-PAGE
Lane A:protein marker; Lane B:solubilized MA104 cell membrane; Lane C:purified receptor
(2)受体蛋白质特性分析：图4可见BRV受体经胰蛋白酶及Pronase E蛋白酶消化后，在SDS-PAGE上相应受体蛋白区带消失。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 原代沙鼠肾细胞流行性出血热双价疫苗临床观察与免疫学效果研究
下一个医学论文： 人乳头瘤病毒16型致瘤基因E6在昆虫细胞中表达及其蛋白抗原特性的初步研究
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文