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恶性疟复合多价抗原基因在小鼠中免疫应答的初步研究 |
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中心所合成，序列为:
HindⅢ EcoRⅠ SalⅠ
5 AGCTTATGGAATTCATGG 3
3 ATACCTTAAGTACCAGCT 5
4. 接头与AB基因的串联:见图1。
图1 pSV2/AB及pREP9/AB真核表达载体构建策略图
Fig1. Cloning strategy of eukaryotic expression vectors pSV2/AB and pREP9/AB
5. 序列分析及酶切鉴定:用HindⅢ/BamHⅠ从pWRAB-1中切下带有接头的AB片段，克隆到pUC18中，进行PCR自动测序。 小量抽提质粒pREP9/AB 及pSV2/AB，其中pREP9/AB经HindⅢ/ BamHⅠ双酶切，8.0% PAGE鉴定; pSV2/AB经EcoRⅠ酶切后，1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
6.小鼠免疫:按常规方法大量抽提质粒pSV2/AB、pREP9/AB、pSV2-neo及pREP9。健康雄性BALB/c小鼠，8周龄，19～22g/只，每组5只。 DNA溶液注射于小鼠右下肢股四头肌，注射量均为100μg/只。实验共分为pSV2/AB组、pSV2组、pREP9/AB组、pREP9组及空白对照组(注射100μl ddH2O/只)。
7. ELISA法检测特异性抗体:参照文献〔4，5〕进行, GZ-AB抗原的纯化如前所述〔4〕。 免疫0周开始自小鼠尾静脉采血约50μl,分离血清,隔周采血一次。鼠抗血清自1∶100始倍比稀释。HRP-兔抗鼠IgG购自华美生物工程公司，1∶2000稀释。阳性对照抗恶性疟原虫血清为第一军医大学分子生物学研究所制备。
8. 迟发性超敏反应(DTH):参照文献〔4〕进行，皮下注射抗原GZ-AB 1.0μg/只，观察注射部位变化。
9. 安全性:观察注射部位变化，小鼠行为、食欲及体重等。免疫后8周，部分小鼠，作大体解剖。
结 果
1. 序列分析和质粒酶切电泳及结果:克隆在pUC18带接头的AB片段, 经PCR测序证实与设计的一致(结果未显示) , 保证了所克隆基因读框的正确性。 pSV2/AB经EcoRⅠ酶切后，切出了约2.6kb及3.4kb的两条目的条带(见图2), 这是由于在接头的5 端设计了一个EcoRI位点, 使pSV2/AB质粒上有两个EcoRⅠ位点; pREP9/AB经HindⅢ/BamHⅠ酶切后，切出了约360bp的AB片段, 大小正确〔3〕。
图2 pSV2/AB经EcoRI酶切的1.0%琼脂糖电泳图谱
Fig2. pSV2/AB digested with EcoRI (1.0% agarose)
1 pSV2 plasmid; 2 pSV2 EcoRI; 3,4 pSV2/AB EcoRI; 5 λDNA HindⅢ
2. ELISA结果:ELISA结果用其滴度的倒数表示(见图3); pSV2、pREP9及空白对照组抗体滴度均小于1∶100(未列出)。
图3 ELISA测定复合多价DNA疫苗诱发特异性抗体结果
Fig3. Specific antibodies induced by multivalent DNA vaccine of P. falciparum detected by ELISA
3. DTH结果:疫苗组小鼠皮下注射GZ-AB抗原后第二天，可见注射部位出现红、肿、局部发热等明显的DTH反应体征，见表1:
表1 恶性疟复合多价DNA疫苗诱发DTH结果
Table1. Results of DTH reaction induced by multivalent
DNA vaccines of P.faciparum
Group 1d 2d 3d
pSV2/AB + ++ +/-
pSV2 - - -
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