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p185抗体可致小鼠流产的研究 |
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物可诱导BALB/c鼠产生较强的免疫应答反应，说明p185具有免疫原性〔7，8〕。由于无乳腺癌的小鼠动物模型，无法在体内研究p185的免疫原性，因此我们利用该抗原在胚胎组织中高表达，设计通过免疫雌性鼠诱导其流产，从而验证p185的免疫原性。
材料与方法
1.细胞株：3T3-neu 细胞为转染人HER2/neu全长cDNA的小鼠纤维母细胞，经ELISA检测高表达p185蛋白。
2.试剂：Sephadex G200 为Pharmacia产品，粒度40～120μm.制备型层析柱25×95cm,Tris-HCl(pH7.0)缓冲液为样品洗脱液。抗p185胞外区单抗(c-neu,Oncogen science Inc产品)。
3.动物：雌性/雄性BALB/c鼠，16～18g体重，购自上海生物制品研究所。
4.p185蛋白的粗制品：3T3-neu细胞108，加裂解液10ml(1mmol/L PMSF,1mmol/L Benzamidine,1μg/ml Aprotinin),4℃作用60分钟，10000r/min低温离心去沉淀，上清过Sephadex G200层析柱，用蛋白检测仪和ELISA检测p185洗脱峰，混合各阳性管为p185粗提物，用p185单抗免疫沉淀后作Western blot分析，经PBS透析后测蛋白浓度，分装保存于-20℃。
5.动物免疫：用上述p185粗制品100μg/ml辅以福氏佐剂按常规皮下免疫BALB/c雌性鼠，经3次免疫后10～12天从眼眶静脉取血，用我室的SKBR3-细胞ELISA法〔9〕验证p185抗体产生。用单独福氏佐剂免疫为对照组。
6.动物交配及流产的研究：将经p185粗制品免疫并证实产生抗体的雌性鼠与雄性鼠按3∶1比例同笼饲养，通过观察雌性鼠阴栓的形成确证其交配成功，通过计算各组每只鼠的平均产仔数及各阶段解剖小鼠子宫观察流产情况，用福尔马林即刻固定子宫组织并做病理检查。
7.HE染色及免疫荧光染色：均按常规方法进行。荧光染色法检测免疫复合物简述如下：切片按常规脱蜡，经PBS充分洗涤以去除可能存在的非特异性IgG粘附，用蒸馏水漂洗脱盐，加FITC-抗鼠IgG复合物(第二军医大学免疫学教研室曹雪涛教授提供)，37℃反应30分钟后用PBS冲洗，荧光显微镜观察。
结 果
1.3T3-neu 细胞裂解上清经Sephadex G200层析后P185蛋白的收集：取10ml的3T3-neu细胞裂解上清作为Sephadex G200层析柱分离，经Tris-HCl缓冲液洗脱，A280监测蛋白洗脱峰，样品经ELISA检测证实p185存在于第一个蛋白峰中。混合各阳性管作为p185蛋白粗提物，进一步与c-neu5单抗反应作Western blot分析，证实p185蛋白存在(图1)。
图1 Sephadex G200分离p185蛋白的Western blot鉴定
Fig1. Western blot of p185 onco-protein crude products derived from 3T3-neu transfected cell lysates by Sephadex G200 chromatography colum.
A.Marker; B.The pellets of cell lysis; C.The supernatant of cell lysis; D.The Immunoprecipitate p185 protein in crude products with c-neu 5 anti-p185 McAb
2.免疫BALB/c鼠血清中p185抗体水平检测：免疫鼠血清经人的乳腺癌细胞株MCF-7(p185蛋白低表达)预吸收后用另一高表达p185蛋白的SKBR-3人乳腺癌细胞株作为抗原检测交配前后血清中的抗体水平，结果(表1)显示免疫组鼠产生p185抗体阳性，且在交配后23天血清中仍有较高水平抗体。
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