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藻酸双酯钠与细胞因子对巨核细胞生成的调控作用 |
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esis and its HBD is an important domain of the action.
MeSH Blood platelets; Fibroblast growth factor, basic; Megakaryocytes
巨核细胞生成过程受多种正(刺激)性和负(抑制)性细胞因子的调控,作为血小板α颗粒主要成份的血小板反应蛋白(thrombospondin,TSP)是否能影响巨核细胞生成未见报道。近来研究表明，细胞因子的活性也受一些多糖类物质的调节［1］，有报道低分子量肝素fraxiparin(多糖类)对巨核细胞生成具有正调控作用; 但肝素类物质对凝血系统影响较明显。本文选择一种对凝血作用影响较小的类肝素物质——藻酸双酯钠,结合包括TSP在内的多种巨核细胞正、负调控因子,研究它们对巨核细胞生成的影响。
材料与方法
一、材料：
1.细胞因子：重组的鼠IL-3、6、GM-CSF,重组的人EPO(rhEPO)为美国Genezyme产品;rhbFGF、TGFβ1 为R＆D产品；TSP从新鲜制备的凝血酶刺激的血小板中纯化而来，由Legrand教授(法国INSERM、Unit 353)惠赠，rhTSP多肽片段(TSP1-174,含HBD) 及rhTSP多肽片段(TSP559-669,无HBD)分别由以色列Biotech General Ltd及Jack Lawler博士(美国Havard Medical School)提供；人PF4为法国Sanofi Choay产品。
2.藻酸双酯钠(propylene glycol alginate sodium sulphate,PSS) 为青岛三药厂产品。
3.再障猪血清(aplastic pig serum, APS)：采集经全身照射(剂量为8 Gy)后第5 d的猪全血并分离出血清。
二、方法：
1．鼠巨核细胞祖细胞(CFU-MK)及粒－巨噬细胞祖细胞(CFU-GM)培养：
(1) 正常鼠骨髓单个核细胞(MNC)制备：6～8周龄Balb/c鼠经颈椎脱位处死，取其股骨，用5～10 mL α－MEM冲洗髓腔,骨髓细胞经淋巴细胞分层液分离MNC。
(2) 去除成熟细胞组份的鼠骨髓细胞 (Lineage negative，Lin-)制备：在上述MNC中加入抗鼠B细胞单抗(RA3-6B2)、抗鼠粒细胞单抗(RA6-8C)、抗鼠巨噬细胞单抗(M1-70.15)、抗鼠Ly-2单抗(CD8a)及抗鼠L3/T4单抗(CD4)(均为美国Caltag Lab产品)，经孵育、洗涤后,加入包被羊抗鼠IgG的磁珠(挪威Dynal产品),通过磁力方法除去MNC中上述成熟的细胞,未被吸附的细胞，即为Lin-骨髓细胞，详细方法见文献［2，3］。
(3) 血浆凝块培养系统(plasma clot system, PCS)：每毫升培养体系含有2×105骨髓MNC(Lin-细胞为8×104/mL)、1%去离子BSA(Sigma)、10%枸椽酸抗凝牛血浆(法国Flow Lab)、1×10-4mol/L 2-巯基乙醇、0.34 mg CaCl2及各种待测因子与PSS, 接种于Petric培养碟(1 mL/碟，Lin-细胞培养接种在24孔板，0.25 mL/孔;每个浓度接种3碟/孔，重复3次，下同)。37℃，5％CO2条件培养7 d，凝块经干燥、固定、染色后计数CFU-MK及CFU-GM数，方法详见文献［3］。
(4) 无血清琼脂培养系统(serum free agar system, SFAS)：每毫升培养体系为含2×105骨髓MNC，0.3％琼脂(Sigma)，1×10-4mol/L 2－巯基乙醇, 30％ 血清替代物α－MEM以及不同浓度PSS，接种于Petric培养碟(1 mL/碟)，培养时间、染色等方法同PCS。血清替代物的制备见文献［4］。
2．白血病细胞集落检测：采用PCS。在24孔培养板中，每孔接种1×103HEL细胞(巨核细胞系)及50 μg/mL的PSS。方法详见文献［5］。
3． ［125Ⅰ］-bFGF结合试验：
(1) ［125Ⅰ］标记bFGF：应用氯胺明－T(chloramine- T)方法对rhbFGF进行 ［125Ⅰ］(Amersham)标记。标记后的 ［1上一页 [1] [2] [3] 下一页
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