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尼可地尔降低血管平滑肌细胞内ATP诱导的游离钙浓度 |
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血管［1，2］。细胞内［Ca2+］i是决定血管平滑肌张力和活动的主要因素［3，4］，本研究探讨尼可地尔对血管平滑肌细胞内［Ca2+］i的影响。
材料与方法
(一)试剂：胰蛋白酶、依地酸、依他酸、小牛血清、ATP、尼可地尔和优降糖均为美国Sigma公司产品，尼可地尔用蒸馏水溶解，优降糖溶于0.001%二甲基亚砜(DMSO)。
(二)细胞培养：取8周龄兔的胸主动脉行移植法，即精心剥去内皮和外膜，中层组织切成1～2 mm2的碎块，在含2 g NaHCO3、 20%小牛血清、 100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640 培育液和37℃条件下，用CO2孵箱培养，3 d更换1次培养基，2～3周后放入含0.1%的胰蛋白酶和0.02%依地酸的Hanks溶液中，细胞松散，用组织细胞计数器计数，然后放入含RPMI 1640培养液的培养皿中，用电镜进行细胞鉴定［5］，采用8～10代细胞进行实验。
(三)［Ca2+］i的测定：培养5 d后，血管平滑肌细胞用Hanks液清洗2遍，用含0.02%依地酸的0.1%胰蛋白酶消化后，再清洗。细胞存放液为(mmol/L)： NaCl 137， KCl 5.37， MgSO4*7H2O 0.57， NaH2PO4 0.42， KH2PO40.44，葡萄糖11， HEPES 109，CaCl21.8，小牛血清0.2% (w/v)。调整细胞数为5×108/L，然后用Fura-2AM(终浓度2.5 μmol/L)在37℃下培养50 min，取出离心4 min，清洗后放入测定液用台盼蓝检测细胞变异情况，用RF-5 000(日本)荧光分光光度计检测加入ATP、尼可地尔、优降糖后［Ca2+］i［6］。
(四)统计分析：数据用表示，采用t检验进行统计分析。
结果
(一)ATP诱导的［Ca2+］i增加：加入ATP(0.1% mmol/L)后［Ca2+］i的增加有峰相和持续相，在细胞外液含钙时，血管平滑肌细胞内［Ca2+］i为(170±20) nmol/L (n=20)，如先加入尼可地尔可抑制ATP诱导的［Ca2+］i的两个增高相(表1)。
表1 尼可地尔对培养血管平滑肌细胞ATP
诱导的［Ca2+］i增加的影响
Tab 1 Effects of nicorandil(Nic) on ATP (0.1 mmol/L)-induced
increased of cytosolic Ca2+ in Fura-2 AM-loaded cultured rabbit
vascular smooth muscle cells in the presence of extracellular Ca2+
(ATP added 0.001% DMSO as control, ，n=5)
［Ca2+］i peak phase
(nmol/L) ［Ca2+］i sustained phase
(nmol/L)
Control 550±40 370±12
Nic 1 μmol/L 508±49* 350±17*
Nic 10 μmol/L 410±38*△ 270±16*△
Nic 100 μmol/L 280±22*△☆ 160±19*△☆
*P＜0.01， vs control；△P＜0.01， vs Nic 1 μ mol/L；☆P＜0.01， vs Nic 10 μmol/L
在细胞外液无钙条件下，［Ca2+］i为(86±9) nmol/L (n=20),尼可地尔(10 μmol/L)可抑制ATP诱导的峰相增加，但对持续相增加无影响(见表2)。
表2 尼可地尔、优降糖对ATP诱导的血管平滑肌
［Ca2+］i变化的影响
Tab 2 Effects of nicorandil 10 μmol/L) on ATP(0.1 mmol/L)
-induced biphasic increase of ［Ca2+］i in Fura-2 AM-loaded cultured
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