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反义N |
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供。受体菌E.coli HB 101为本室储存。限制性内切酶购自德国GIBCOBRL和Promega公司，Ang Ⅱ购于Sigma公司。
二、方法：
1.构建fpGV1-MT-N-ras 1(exon 1)逆转录病毒重组载体，得到重组质粒后用EcoR1、Bg 1Ⅱ双酶切鉴定。
2.细胞培养、转染及抗性克隆的筛选：取出生后1～3 d的正常Wistar大鼠乳鼠，按Scott等［3］方法培养心肌细胞。包装细胞PA317和NIH3T3细胞均用含有10%～20%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO2条件下进行培养。用磷酸钙沉淀法将重组质粒导入PA317中，经G418筛选获得抗性克隆，用NIH 3T3细胞测定重组病毒的滴度，挑取高滴度的PA317细胞克隆收集其上清，经40 000 r/min离心60 min浓缩100倍后，转染心肌细胞。
3.RT-PCR定量检测N-ras mRNA表达：采用一步法提取细胞总RNA。用PE公司的反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录以获得cDNA。再进行PCR双扩增反应，同时加入N-ras引物一对和β-actin引物一对在同一体系中扩增N-ras和β-actin这两个目的片段。
N-ras引物序列：
5’-CTGGTGTGAAATGACTGAGT
5’-GGTGGGATCATATTCATCTA
β-actin引物序列：
5 -ATCATGTTTGAGACCTTCAAC
5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCAA
PCR反应条件：95℃，1 min→50℃，30 s→72℃, 1min，共30个循环。1.5%琼脂糖凝胶电泳分析结果。
4. Western印迹检测p21蛋白的表达：细胞总蛋白的提取，聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，电转移后显色，用N-ras p21抗体检测p21蛋白并进行定量分析。
5.细胞计数方法：消化贴壁生长的细胞制成悬液并调整至细胞5×104个/mL，移入24孔培养板中，孵育24 h后换成含2%胎牛血清的培养液，继续孵育24 h加入Ang Ⅱ，再培养72 h，用血细胞计数板进行计数。
6.液闪计数法检测［3H］-胸腺嘧啶核苷(［3H］-TdR)细胞内掺入情况：心肌细胞接种及检测时相同前。检测前4 h每孔加入2.5 μL ［3 H］-TdR［(3.7×1010Bq/mL)，中国原子能科学研究院］。收集细胞，破膜，液闪计数。每次计3孔，取平均值。
7.细胞体积测定：细胞体积是通过测量细胞直径获得的。将各组心肌细胞分别接种于培养皿内， 按上述方法加入干预因素72 h后，中止培养。用无Ca2+、Mg2+的Hanks液快速冲洗长满细胞的培养皿3次，加入2 mL 0.25%的胰酶溶液约10 min后加入3 mL含有10%胎牛血清的培养基终止消化。在倒置显微镜下，可观察到细胞呈圆型，每组随机选择20个细胞，用计算机MICC软件测量细胞的直径，通过直径计算出每个细胞的体积。
三、统计处理：
数据以表示，组间用t检验判定均数差异显著性。
结果
一、重组质粒的酶切：
质粒载体为fpGV1-MT，长度为5.8 kb，N-ras 1 cDNA片断长度为0.9 kb,EcoRⅠ、Bg1 Ⅱ酶切。
二、重组逆转录病毒滴度的测定：
取PA317抗性克隆株培养上清制备病毒悬液，感染NIH 3T3细胞，经G418筛选，2周后根据长出的克隆计算病毒的滴度为2×105 CFU/mL。
三、反义N-ras 1基因对心肌细胞增殖的影响：
如图1所示，此结果表明在细胞水平上，转染了重组逆转病毒反义N-ras 1基因的心肌细胞的增殖受到一定程度的抑制。而转染了正义N-ras 1基因的心肌细胞的细胞计数与加入Ang Ⅱ刺激的心肌细胞相比无显著差异(P＞0.05)，说明正义N-ras 1基因对细胞增殖无抑制作用。
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