|
小麦耐盐突变体的分子生物学鉴定 |
| |
鉴定等方面的研究，且取得了另人瞩目的成果〔3～5〕。
用醇溶蛋白电泳和RAPD 方法对突变体和亲本进行分析，从而在蛋白质水平和DNA 水平上为小麦耐盐突变体的真实性提供了有力的证据；用RAPD方法对突变体之间的差异进行分析表明，突变体是一系列遗传背景相似而耐盐性有差异的近似等位基因系，为小麦耐盐性研究提供了一套好材料。
1 材 料 和 方 法
1.1 材 料
1.1.1 植物材料 供试材料RH8706-49、H8706-34、H8706-44、H8706-48、H8706-57为濮农3665/百农3039F1经花药培养、EMS诱变、耐盐性反复筛选得到的同一单株的后代，它们耐盐性不同且均经过连续9代自交选择，详见文献〔2〕。
1.1.2 试剂 10-mer随机引物购自美国Operon公司；Taq酶购自华美生物工程公司；dNTPs购自Bio-Lab。
1.1.3 PCR仪 为MJ公司的PTC-100TMProgrammable Thermal Controller。
1.2 方法
1.2.1 醇溶蛋白电泳 参照傅宾孝的方法〔6〕，点样量为8μl。
1.2.2 小麦核DNA的提取 取液氮冷冻叶片3～5g，在液氮冷冻下迅速研磨成粉末。放入50ml离心管中，然后加20ml缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，pH8.5；50mmol/L EDTA，pH8.0；2%SDS；100mmol/L NaCl)及100μl蛋白酶K(终浓度为0.05mg/ml)，充分摇匀。将离心管置于65℃水浴1～2h，此过程中均匀地混合几次。取出离心管，每管加入等体积的酚/氯仿(1∶1)，混匀后，3 000 r/min 离心20min。将上清液移入另一离心管中，加入等体积的氯仿，混匀后，3 000 r/min 离心20min。取上清液于另一离心管中，加入0.6V异丙醇，轻轻混匀，静置一段时间，然后用玻璃钩挑出DNA，并用70%乙醇冲洗2～3次，气干。将DNA溶于5ml TE中，加入100μg RNase(不含DNase)37℃酶解1～3h 。加入等体积酚/氯仿，轻轻混匀，3 000 r/min 离心15min。取上清，加入等体积的氯仿，混匀，3 000 r/min 离心15min，取上清。加入1/10V 3mol/L NaAc(pH5.2)混匀后加入2V 100%冷乙醇，玻璃钩挑出DNA，70%乙醇洗2～3次，气干。加入适量TE溶解DNA。 以OD260测定DNA浓度，以OD260/OD280检测核酸纯度。
1.2.3 RAPD 反应 参考Williams方法〔7〕略有改动。反应体系为20μl，其中含模板DNA 50ng，Taq 酶0.9U，dCTP、dATP、dGTP、dTTP终浓度各为0.1mmol/L，1μl随机引物。
扩增反应条件：90s/94℃预变性 ，45s/94℃、45s/36℃、120s/72℃，循环40 次，然后72℃延伸4min，扩增产物在1.1 %琼脂糖凝胶中电泳后，于0.5μg/ml EB 的水溶液中染色30min，以蒸馏水脱色20min后，观察并拍照。各扩增反应至少重复3次。
2 结 果 与 分 析
2.1 小麦耐盐突变体生化水平变异（醇溶蛋白）的分析
按前述方法进行供试品种醇溶蛋白的提取和电泳，以加拿大硬红春小麦Marquis姾蚇epawa为对照品种，结果如图1。如箭头所示，5个突变体均比其亲本多一Rf为0.19的区带，控制醇溶蛋白的各组分已有明确的染色体定位，有关基因分别位于第一和第六同源染色体组的短臂上，而控制大分子量γ、ω蛋白亚基的基因则位于第一同源染色体组的短臂上〔8〕；突变体的这一特异区带位于γ区，可见耐盐突变体的突变部位可能在第一同源染色体组的短臂上。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 云南纵坑切梢小蠹四个地理种群同工酶比较研究
下一个医学论文： 玉米细胞质雄性不育新类型Bao I Bao II 的发现
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文