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MTHFR基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗塞的关系 |
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1.1 研究对象
病例组为依据全国第三届脑血管病诊断标准，经临床检查(病史、体征、生化检验、CT)确诊为动脉粥样硬化性脑梗塞患者62例；对照组为无血缘关系的健康个体79名。所有受检者均为无血缘关系的东北地区汉族。采取外周静脉血5ml，-20℃保存至提取基因组DNA。
1.2 引物
引物序列为 NCO-351: 5 -GAA GCA GGG AGC TTT GAG GC- 3 ；NCO-352: 5 -CCC ATG TCG GTG CAT GCC TT- 3 。
1.3 基因组DNA提取
按常规方法, 经蛋白酶K-SDS处理, 酚/氯仿抽提, 无水乙醇沉淀提取基因组DNA。
1.4 MTHFR基因特定片段的PCR扩增
PCR反应总体系30μl，包括4×dNTP 1.5μl (2.5mmol/L)；引物NCO－351、NCO－352各1μl (6pmol)；TaqI酶(PROMEGA)1.5U；模板DNA 5μl。
PCR扩增条件为: (1) 94℃预变性5分钟; (2) 30个循环扩增, 94℃ 30秒, 62℃ 30秒, 72℃1分钟; (3) 72℃延伸 5分钟。 PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭(EB)染色检验扩增结果，以备下一步实验。
1.5 限制性酶切PCR扩增产物
TaqI酶切体系20μl, 包括PCR 扩增产物 10μl；TaqI (10U/μl)0.2μl；10×缓冲液2μl；ddH2O 7.8μl。酶切产物在65℃ DZKW-C型水浴锅中过夜。
1.6 电泳检测
12%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物，银染分析电泳结果。
2 结 果
2.1 MTHFR基因C677T多态基因座的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
MTHFR基因C677T基因座基因片段经TaqI 限制性酶切后，可分出3种基因型。677基因座原有的C突变为T后可产生一个TaqI 限制性酶切位点。未突变纯合子(基因型AA)基因序列中无TaqI 限制性酶切基因座，所以仅见一条电泳带，134bp；突变纯合子(基因型VV)可见两条电泳带，分别为75bp、59bp；突变杂合子(基因型AV)可见三条电泳带，分别为134bp、75bp、59bp (见图1)。( MTHFR基因C677T突变，导致丙氨酸残基(Ala)变成缬氨酸残基(Val)，本研究用A表示野生型等位基因，V表示突变型等位基因) 。脑梗塞组与对照组的MTHFR基因型频数和基因型频率分布(见表1)。
图1 MTHFR基因TaqI酶切片段电泳图谱
1.pBR322/MSP I;2、4、9.V/V;3、5、8.A/V；6、7.A/A。
表1 脑梗塞组和对照组MTHFR基因型频数和频率分布
分 组 例 数 基因频率 等位基因频率
AA AV VV A V
脑梗塞 62 12
(0.194) 35
(0.565) 15
(0.242) 0.476 0.524
对 照 79 26
(0.329) 43
(0.544) 10
(0.127) 0.601 0.399
2.2 实验结果的统计学分析
脑梗塞组和对照组人群MTHFR基因型分布经χ2检验均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)。
脑梗塞组和对照组人群MTHFR基因的突变等位基因V频率经χ2检验，χ2＝4.41，P<0.05，有显著性差异。
脑梗塞组和对照组人群MTHFR基因型频率经χ2检验，AA: χ2=3.24，P>0.05；AV: χ2=0.05，P>0.05；VV: χ2=3.17，P>0.05， 三种基因型频率均无显著性差异。
脑梗塞组和对照组人群MTHFR基因型频率的相对风险分析，AV/AA：RR=1.76，AV基因型比AA基因型患脑梗塞风险高1.76倍；VV/AA：RR=3.25，VV基因型比AA基因型患脑梗塞风险高3.25倍。
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