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大鼠运动皮层甘氨酸免疫反应性神经元的分布及其超微结构特征 |
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ic axosomatic synapses,but the symmetric type accounted for 80% of the total synapses.Likewise,these two types of synapse were also characterized on the Gly-ir dendrites,but the percentage of asymmetric synapses increased progressively with distance from soma.Conclusions These data first reported the presence of the Gly-ir neurons in the cerebral cortex.However,it remains unknown whether glycine acts as a neurotransmitter in neocortex, needs further studies.
Key words：Glycine;Immunocytochemistry;Electron microscopy;Motor cortex;Rat▲
甘氨酸(glycine,Gly)是中枢神经系统抑制性神经递质之一，而且是脊髓及部分脑干神经核团内中间神经元的主要抑制性递质，参与感觉传入及运动反射的调控［1］。然而，关于Gly在皮层内是否作为抑制性神经递质参与锥体神经元的调控至今仍不明了，并有较大的争议［2～4］。近年来有关Gly的许多生理、生化及受体的研究均表明，Gly可能是皮层内抑制性递质之一［2，3，5～7］，因为将甘氨酸拮抗剂士的宁(strychnine)直接用于大脑皮质可引起惊厥［8］。而微电泳Gly则可使皮层内约15%～20%的神经元的细胞膜电位超极化、放电频率阻断、EPSP-IPSP的幅度及膜阻抗降低，从而抑制皮层内神经元的活动［2，5］。Engblom等［6］证明皮层内Gly与GABAA受体一样，可介导Cl-内流而使神经元超极化。但也有研究证明Gly在大脑皮层的作用主要在于调制NMDA受体通道复合体、加强Glu的活性［4］。自从Gly受体(GlyR)抗体制备成功，人们发现GlyR广泛分布于皮层内锥体神经元胞体及顶树突［3，7］，而关于Gly-ir神经元在皮层内的分布及其特征却至今未见报道。为此，本实验用免疫组织化学与免疫电镜方法研究Gly免疫阳性神经元在运动皮层内的分布及其形态和超微结构特征。
材料和方法
雄性SD大鼠9只，体重180～250g。动物经戊巴比妥钠腹腔麻醉(42mg/kg)、由心脏灌流生理盐水100ml后，再充以0.1mol/L磷酸缓冲液(PB，pH7.4)配制的4%多聚甲醛和0.5%～2.5%戊二醛溶液，灌流固定40～60min。取脑于4%多聚甲醛溶液中后固定1～2h，0.1mol/L PB(pH7.4)漂洗数次后，振动切片20～30μm,保存于0.1mol/L PB溶液中。免疫组织化学方法步骤如下：含3%正常羊血清(NGS)+0.03%Triton X-100的磷酸缓冲盐溶液(PBS)2h；抗Gly多克隆抗体(1∶500～1 000,Chemicon)孵育液，4℃，48～72h；然后用羊抗兔lgG和兔-PAP复合物(均为1∶200，上海医科大学病理教研室产品)，室温下孵育1～2h；DAB显色。各步骤之间均以0.02mol/L PBS(pH7.4)充分漂洗。光镜切片经裱片、晾干、脱水、中性树指封片、显微镜观察。部分切片在光镜下选片后按电镜常规包埋，步骤简述如下：1%锇酸1h，升度丙酮脱水，Epon 812包埋于60℃,48h聚合。超薄切片，JEM-100CXll电镜观察并摄片。
对照试验：用3%NGS代替一抗做空白对照，染色结果呈阴性。
方法：(1)层次分布：选取3只大鼠运动皮层的5张20μm切片(Fr.1或Fr.3区)，在显微镜(×250)下通过Camera lucida将Gly-ir神经元描绘于白纸上，再从皮层表面至白质在纸上标出宽为500μm的柱状范围，层次的边界通过邻近焦油紫染色切片确定；然后计数每个层次的阳性细胞数，压在右、上线的细胞计数，而左、下线的细胞则不计。(2)细胞大小：在总放大倍数为500倍下，每一层测量50个阳性神经元(Ⅰ层：25个)的长、短径，再根据两者的平均直径和形态对神经元进行分类和计算百分比。(3)电镜观察：将电镜下观察到的阳性标记结构全部摄片并记录。在解剖镜下观察与测量电镜底片上阳性标记结构周围的各种终末上一页 [1] [2] [3] 下一页
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