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突触数密度Disector测量法的建立与计算机辅助分析的实现 |
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raphs of known distance apart were selected to make up the Physical Disector,and the synaptic numerical density was counted according to the Disector principle.The computer-aided analysis system for synaptic numerical density based on the Disector technique(DisectorCountor 1.0) was developed on the Windows95 system with the Visual Basic 4.0.Results There was no significant statistical difference (P＞0.05) between the result by hand and that with Disector Countor 1.0.Conclusion With the advantage of being highly objective and efficient,the computer-aided analysis system for synaptic numerical density based on the Disector technique,Disector Countor 1.0,would be the developmental direction for synaptic numerical density analysis.
Key words：Synapse;Numerical density;Stereology;Disector technique;Computer software▲
突触的数目在神经系统的发育与衰老、损伤与修复、可塑性与学习记忆等生理病理过程中具有明显变化，准确计数神经组织中突触的数目是神经生物学研究方法亟待解决的难题［1，2］。体视学技术是应用数学方法对固体组织的剖面进行空间解释和估算的方法。Disector技术是一种利用若干组相邻平行二维剖面计数三维空间中任意形状粒子数目的体视学方法，具有计数效率高、无偏差等优点，是80年代以来空间粒子计数技术领域的重大突破［3，4］。计算机辅助生物图像分析技术是在生物学、计算数学和计算机数值分析技术等学科基础上形成的交叉学科，已广泛应用于生物图像的定量分析［5，6］。我们利用本文探讨应用Disector技术测量突触数密度的可行性和具体步骤，以及基于该技术的突触数密度计算机辅助分析的原理和过程。
材料和方法
1.突触数密度Disector测量法的建立
1.1 组织包埋块的制备：30d龄Wistar大鼠3只。复合麻醉剂腹腔麻醉，左心室插管，37℃生理盐水50ml快速冲洗，4℃含2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1mol/L PBS(pH 7.4)250ml灌注，持续30min。开颅取脑。4℃含3%戊二醛的0.1mol/L PBS(pH7.4)后固定4h。0.18mol/L蔗糖冲洗液(4℃)冲洗3次，4℃冰箱过夜。次日，振动切片机额状切片，片厚50μm。每只动物从海马完整的厚片中随机抽取5～10片。1%锇酸固定1h(4℃)。618环氧树脂平板包埋。
1.2 连续超薄切片的制备：每只动物从平板包埋的厚片中随机抽取1片，解剖显微镜下取CA1区，切取半薄切片，1%甲苯胺蓝染色，依据半薄切片定位修块。超薄切片机连续超薄切片，每1厚片选取2～3条由6～10片连续超薄切片构成的切片带，裱于独眼铜网。醋酸铀-枸橼酸铅双重染色。
1.3 电镜摄片的方法：每只动物从切片带中随机选取1条，TM100X-Ⅱ透射电镜下观察摄片。选取切片带的第1张切片，1 400倍下，寻找锥体细胞的胞体的位置，确定海马辐射层的位置和范围，在该范围内随机选取1个仅由1个内皮细胞构成的毛细血管。在该毛细血管周围随机选取神经毡，7 200倍下摄片。选取第2张切片，1 400倍下，寻找定位的毛细血管，并以此确定与上一拍摄视野在同一纵轴上的视野(即相邻视野)，7 200倍下摄片。同样方法依次观察并拍摄剩余切片，每条切片带摄片5～9张。
1.4 Disector法与突触数密度的测量：Disector是由两个间距为h的平行平面构成的三维测试系统，其中1个平面称为计数平面(reference plane)，上覆Gundersen测试系统，用于确定测试范围上一页 [1] [2] [3] 下一页
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