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成年大鼠纹状体区神经干细胞的分离培养 |
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的路径迁移到嗅脑并分化为中间神经元［1～3］。其次，在90年代人们又分离了能不断分裂增殖且具有多种分化潜能的细胞群，并提出了神经干细胞的概念［4～6］。这种神经干细胞如能被特异性地诱导分化为某种特定神经元以替代丢失的神经元，无疑将为中枢神经系统功能重建和神经再生带来新的希望。本实验首次采用单细胞克隆建立细胞系的方法获取大量亚克隆，在证实其自我更新能力和多分化潜能基础上使用胚胎早期细胞特异性抗原Nestin证明我们所分离的细胞群为神经干细胞，以期为进一步使用和研究神经干细胞奠定基础。
材料和方法
1.动物及主要试剂来源
1.1 动物：由第三军医大学动物实验中心提供成年Wistar大鼠(4月大小)。
1.2 细胞培养试剂：DMEM/F12和B27(Gibco)、bFGF(Sigma)、胎牛血清(杭州四季青生物材料研究所)。
1.3 单克隆抗体及多克隆抗体：抗Nestin IgG(Mckay RDG和Luskin MB惠赠，USA)、5-溴尿嘧啶及其抗体(bromodeoxyuridine,BrdU,Fluka公司提供)、抗NeuN IgG(neuronal nuclei,NeuN,由Dr Mcburney惠赠，USA)、抗GFAP和2，3-环核苷酸磷酸二脂酶IgG(cyclic nucleotide phosphohydrolase,CNP)由Promega公司提供。
1.4 其他试剂：SABC-Cy3荧光试剂盒(Sigma,博士德公司代理)、FITC荧光二抗(中山公司)。
2.方法
2.1 神经干细胞的分离和传代：取成年大鼠(4月大小)纹状体组织，D-Hank液漂洗，解剖显微镜下剥离脑膜，将上述的脑组织转移到DMEM/F12(1∶1)加B27的无血清培养基，吸管吹打机械分离制作单细胞悬液，台盼蓝染色后细胞计数，于每培养瓶中(75ml培养瓶)加入5×105个细胞，同时加用bFGF(20μg/L)。待原代克隆形成后再次机械分离克隆制作单细胞悬液，每培养瓶中加入5×104个细胞。此后每6～9d机械分离克隆传代1次，方法同前，仍采用无血清培养基加bFGF。在传代的同时进行克隆形成实验，计数每代细胞的克隆形成率。
2.2 单细胞克隆及连续传代：采用有限稀释法。选取原代克隆制作的单细胞悬液，细胞计数后稀释到40个细胞/ml，于96孔培养板中滴加稀释的细胞悬液(每孔50μl细胞悬液和50μl无血清培养液，1～2个细胞/孔)，2h后相差显微镜下观察计数，选取仅有1个细胞的培养孔作记号，动态观察。
选取最初只有1个细胞长成的单细胞克隆，机械分离成单细胞悬液，将1个克隆的所有细胞种入25ml培养瓶中培养(培养基仍同前)，待次代克隆长成后连续传代，最后得到大量来自单个细胞的亚克隆，再行免疫荧光和诱导分化实验。
2.3 BrdU标记：将BrdU溶于无血清培养基，过滤除菌后种入上述的细胞克隆(BrdU终浓度为5μmol/L)，培养7d待新的克隆形成后转移到培养板中(预先置有多聚赖氨酸涂布盖玻片)，贴壁2h行BrdU抗体免疫荧光染色。
2.4 克隆诱导分化：选取部分上述的细胞克隆种植于预先置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的24孔培养板，并加入有血清培养基(5%的胎牛血清+DMEM/F12)，分别于2h后和7d后行免疫荧光检测。
2.5 免疫荧光单标和双标实验：将2.4中贴壁2h的细胞克隆行Nestin免疫荧光单标染色。将来自2.2中的克隆(单细胞克隆后代)按2.4的方法培养7d后行NeuN、GFAP和CNP免疫荧光单标染色，来自2.1中的克隆按2.4的方法培养7d后行NeuN和GFAP免疫荧光双标染色，具体方法参照蔡文琴［7］教授的方法进行。
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