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奥替普拉和反义GST |
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nalyzed by DNA agarose gel electrophoresis and flow cytometry examination. Results GST-π protein content of AT-Rat-1 is lower than that of T-Rat-1 by ELISA.Oltipraz has a obvious effect of inducing AT-Rat-1 cell apoptosis in 130-140mg/L.Meanwhile,it is shown that c-fos mRNA of AT-Rat-1 cell is higher experssion than that of T-Rat-1 by Northern blot analysis. Conclusion The apoptosis of AT-Rat-1 cell can be induced by a effective dose of oltipraz; The high expression of c-fos gene and low expression of GST-π gene are related to AT-Tat-1 cell apoptosis.
Key words：oltipraz; apoptosis; GST▲
用致癌素香烟凝聚物(cigarette smoking condensate,CSC)处理人胚肺组织，提取DNA转化大鼠成纤维细胞Rat-1，能获得一种介于良性细胞和癌细胞之间的恶性转化Rat-1细胞(transformed Rat-1,T-Rat-1),该细胞处在癌变的早期阶段［1］。谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)是人肺癌变早期的精确标记之一，GST-π基因的异常表达也许能抑制细胞凋亡的启动，而促进细胞癌变［2］。我们推测反义GST-π能够抑制恶性转化细胞的癌变，故此构建了一个带有反义GST-πRNA的重组质粒，导入恶性转化Rat-1细胞，并进行了深入研究。
另一方面，oltipraz是从十字花科绿色植物中提取的巯基类化合物，全称：5-(2-吡嗪基)-4-甲1、2-二羟基-3-硫酮。1993年美国NCI倡仪用它作临床Ⅰ期抗癌药物试验。oltipraz防癌抑癌的作用，与其影响GSTs、醌还原酶、环氧化脱氢酶、酪氨酸蛋白激酶(TPK)、细胞色素P450、黄曲霉素B1醛还原酶(AFAR)等密切相关［3］。它是否能诱导某些细胞的凋亡是令人感兴趣的问题。我们将oltipraz与反义GST-π、原癌基因之一c-fos联系起来进行研究，试图在细胞增殖、分化、癌变、凋亡之间找出某些规律性。
材料和方法
1.实验材料
Rat-1细胞为大鼠成纤维细胞，具有异倍体核型，但无致瘤性，属非恶性细胞，由中国医学科学院肿瘤所李申德教授惠赠。PA317细胞为病毒包装细胞，由中国医学科学院分子免疫室孙宗棠教授惠赠。NIH3T3细胞为小鼠成纤维细胞，由陈秋燕博士提供。
质粒GST-π为全长人GST-π cDNA克隆在PUC18质粒中，经EcoRI酶切后获得的0.75kb的GST-π cDNA,由日本东京大学Muramatsu教授惠赠。质粒pDORneo长6.55kb，包含了M-MuLV5′和3′-LTR，SV40早期启动子驱动NED基因，含有部分PBR322片段，可在E.coli中复制并有Amp抗性，多克隆位点上有3个单一酶切点，由中国医学科学院细胞生物室转赠。
探针c-fos为1.3kb，购自中山生物公司。β-actin 2.0kb，购自天象人公司。试剂盒：Prime-gene Labeling Kit Promega,转染试剂Lipofectin(GIBC-OBRL),G418均购自东方生物公司；同位素［α-32P］-dCTP，购自福瑞公司；oltipraz由美国NIH Bourat博士赠送。
2.实验方法
2.1 “恶性转化Rat-1细胞”的获得，参见文献［4］，反义GST-πRNA(pDGSTas)重组质粒构建参见文献［5］，将pDORneo用EcoRI单酶切后直接用碱性磷酸酶CIAP处理1h，电泳回收后取60ng处理过的线性载体加25ng GST-π cDNA片断，在10μl反应体系中T4DNA连结酶连接3h，取2μl转染E.coli HB101上一页 [1] [2] [3] 下一页
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