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肾上腺素对培养的大鼠表皮细胞增殖的影响 |
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设想皮肤局部肾上腺素浓度不同可能是造成这种差异的一个重要原因［1］。为进一步检验这一设想，我们用核仁组织者区银染法(silver-staining technique for nucleolar organizer regions, AgNOR)研究了肾上腺素在不同浓度下对培养大鼠表皮细胞分裂活性的影响。
材料和方法
1. 材料
1.1 动物：Wistar大鼠，出生24h以内，雌、雄不拘，北京医科大学实验动物部提供。
1.2 试剂：DMEM与新生牛血清(Gibco公司)；肾上腺素(酒石酸氢盐)与明胶(Sigma公司)；胰蛋白酶(华美公司)；其余试剂均为分析纯。鼠尾胶原自制［2］。
2. 方法
2.1 表皮细胞的原代培养与纯化：取经消毒后的乳鼠皮肤，剪至1mm3大小，均匀贴附于培养瓶底面，翻转培养瓶，加入适量DMEM培养液(内含25%新生牛血清，100IU/ml青霉素和100mg/L链霉素，pH6.8～7.0)，在37℃，5%CO2培养箱内静置3～4h后，轻轻翻转平放，继续培养。当表皮细胞集落之间的成纤维细胞尚未汇合时，用0.25%胰蛋白酶消化，并在显微镜下观察，至成纤维细胞变圆后，加入含血清的DEME终止消化，轻轻吹打，移除消化液，用PBS洗2次，加入含25%新生牛血清的DMEM继续培养。5～6d后，仍混有部分成纤维细胞的表皮细胞生长成片，再用0.25%胰蛋白酶消化，消化后的细胞悬液接种于未铺胶原的培养瓶中，静止30min，在光镜下观察，见部分细胞贴壁稍加振荡也不浮起时，将培养液连同尚未贴壁的细胞一起移至铺有鼠尾胶原的培养瓶中继续培养。此步骤可重复，直至将成纤维细胞除净为止。
2.2 生长曲线：纯化后的表皮细胞以5×105／ml，2×105／ml和0.5×105／ml的浓度分别接种于24孔板中，从次日起每天同一时间消化其中4孔，计数细胞，连续7d，作出生长曲线。
2.3 分裂指数：取对数生长期细胞消化，以2×105／ml浓度接种于放有盖玻片的24孔板中。每日同一时间取3孔中的细胞，连续7d。细胞经10%中性福尔马林固定，常规HE染色，在细胞密度近似区，观察5 000个细胞，记录其中处于中期分裂象的细胞数。
2.4 肾上腺素对表皮细胞增殖活性的影响：取对数生长期细胞，以2×105ml浓度接种于放有盖玻片的24孔板中培养。24h后换为含1%新生牛血清的DMEM，使细胞饥饿24h。之后，移除孔中培养液，加入含不同浓度肾上腺素和20%新生牛血清的DMEM，继续培养。处理的肾上腺素浓度分别为10-10mol/L，10-9mol/L，10-8mol/L，10-7mol/L和10-6mol/L。肾上腺素各浓度组的细胞均为3孔。对照组不加肾上腺素。培养12h后，取出盖玻片，用95%乙醇固定30min，并进行AgNOR染色。
2.5 AgNOR染色方法及结果分析：经95%乙醇固定的细胞用双蒸水清洗3～4次，每次10min；进入酸化液，孵育5min；除去酸化液，用双蒸水洗3次，方法同上。在暗室内进入AgNOR染液，于20℃孵育30min。用水充分清洗后，再经显影，定影，按常规进行脱水，透明和封片。某些样品不经定影。酸化液内含冰醋酸和无水乙醇，其体积比为1∶3。AgNOR染液由a,b两种原液配成。a液：0.2g明胶溶于5 ml 2%甲酸中；b液：50%硝酸银水溶液。使用前将a与b液按1∶2的体积比混和，过滤。染色后的细胞在图像分析仪(Leica Q550-IW)上进行分析，分析的参数为单位面积细胞核上染色颗粒的面积(AA)和单位面积细胞核上染色颗粒的数目(NA)。每一肾上腺素浓度分析的细胞来自3个不同的孔，每孔观测最先进入视野的细胞30～40个。观测时，显微镜放大倍数为1 000，监视器上的最终放大为4 000倍。
2.6 扫描电镜方法：生长于盖玻片上的细胞用2%戊二醛在4℃固定2h后，按常规脱水，临界点干燥，镀膜。在Hitachi S-450电镜下观察。
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