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云南瑞丽静脉药瘾人群HIV1感染者毒株env基因V3区序列测定研究 |
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区的氨基酸序列并分析了其共享序列的保守性，并与世界其他地区HIV1代表株膜蛋白V3区氨基酸序列进行了比较。
材料与方法
一、标本采集及其处理：16名HIV1感染者均来自我国云南德宏州瑞丽市静脉药瘾人群，其HIV1感染使用中国预防医学科学院研制的HIV1 gp41抗体初筛及确证试剂盒检测证实为无症状HIV1感染者，其外周血CD+4细胞计数及CD+4/CD+8细胞比例均未改变。标本系1992年5月～1994年4月采集。采集5ml静脉抗凝血，使用DNA提取仪(ABI 341 DNA Purification system)提取其外周血单核巨噬细胞DNA，溶于50μl TE中 ，－20℃冻存。
二、HIV1前病毒env基因V3区的套式PCR扩增：根据HIV1 MN株全基因组序列及计算机DNASIS软件进行套式PCR的引物设计及其合成。设计PCR外侧引物EP1：5′-CACAGTACAATGTACACATG-3′(正义，nt 6982～7001)及EP2：5′-ACAGTAGA
AAAATTCCCCTC-3′(反义，nt 7383～7402)。内侧引物EV1：5′-TAAGAATGTCGACTGTACAAGACCCAAC-3′(正义，nt 7130～7153)及EV2：5′-TGTAAGAG
CTCAGTACAATGTGCTTGTCTCAT(反义，nt 7226～7244)。在内侧引物的5′分别导入SalⅠ及SacⅠ识别位点以利于M13测序克隆的构建。取上述HIV1感染者PBMC DNA 1μl作为外侧引物PCR扩增的模板，取外侧引物扩增产物5μl作为内侧引物的模板。PCR混合液为67mmol/L Tris*HCl pH8.8，16mmol/L(NH4)2SO4，2.5mmol/L MgCl2，2.5μmol/L dNTP，引物浓度各为100pmol/L，Taq DNA多聚酶2.5U(Biolabs公司)。使用PE4800 DNA扩增仪。扩增条件为：94℃ 2分钟，55℃ 2分钟，72℃ 2分钟，共35个循环后，72℃ 5分钟结束扩增。外侧引物特异性扩增产物为420bp片段，内侧引物特异性扩增产物为115bp片段。
三、DNA序列测定：取PCR产物200μl，经PCR纯化试剂盒(美国Promega公司)纯化后，参照文献［7］将PCR产物构建M13噬菌体测序克隆，提取单链模板。自动测序使用脱氧终止物标记循环测序试剂盒(ABI公司)，配合M13测序引物及引物标记循环试剂盒(ABI公司)，在ABI公司373A型DNA序列分析仪测定序列。
结 果
一、16株云南HIV1毒株env V3区核苷酸序列测定结果及其共享序列：根据16株HIV1膜蛋白基因V3区的序列测定结果，使用DNASIS分析软件，得出16株HIV1膜蛋白V3区的氨基酸序列及其共享序列(Consensus sequence)，结果见表1。与共享序列相比，株间膜蛋白V3区氨基酸序列变异为0%～23%，平均为7%。
二、16株云南HIV1膜蛋白V3区氨基
表1 16株云南HIV1毒株膜蛋白V3区氨基酸序列测定结果及其共享序列
标本号 HIV1毒株gp120 V3区氨基酸序列(1～35) 同源性% 变异性%
共享序列 C T R P N N N T R K S I Y I G P G R A F H T T G R I I G D I R Q A H C 100 0
YNRL1 -- -- T- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -L -K -- - 91 9
YNRL2 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- L- -- -K -- - 94 6
YNRL3 -- -- S T -- -- R - -- -- -- -- -- P- -- -- -- -K -- - 86 14
YNRL4 -- -- -T -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- - 97 3
YNRL5 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -K -- - 97 3
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