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利用噬菌体肽库确定IL |
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ouri大学Dr.Smith惠赠。抗IL-2Rα单克隆抗体5G1、兔抗鼠IgG、HRP标记驴抗兔IgG系由本教研室制备。豚鼠抗M13多抗系本室自制。HRP标记金葡菌A蛋白购自上海生化所。
1.2 测序试剂 测序引物由美国Missouri大学Dr.Smith惠赠，［α-32P］dATP购自北京市亚辉生物医学公司，DNA序列分析试剂盒系上海Promega生物产品有限公司产品。
1.3 肽库筛选 用单克隆抗体5G1筛选噬菌体六肽库方法参见文献［8］。
1.4 单个噬菌体克隆制备 方法参见文献［8］。
1.5 利用3种不同ELISA法 选出与5G1具有较强结合性的噬菌体克隆，方法参见文献［9］。
1.6 DNA序列分析 对与5G1具有较强结合性的噬菌体提取单链DNA，利用T7DNA聚合酶测序试剂盒，用Sauger双脱氧链末端终止法进行序列分析。
1.7 含保守序列的噬菌体克隆进行生物学活性鉴定
1.7.1 IL-2R阻断试验 5G1（4 μg/ml）包被40孔酶标板（浙江产），1%BSA封闭后，依次加入不同浓度 IL-2R（1 600、800、400、200、100、50），再加含保守序列的噬菌体克隆。阴性对照用Fuse1，空白对照用PBS。作用后加豚鼠抗M13多抗。再加HRP-SPA显色。测OD490，计算抑制百分率，
1.7.2 IL-2竞争抑制试验 5G1（4 μg/ml）包被40孔酶标板（浙江产），1%BSA封闭后，同时加入等体积不同浓度 IL-2(10.00、5.00、2.50、1.25万U、荷兰CHIRON产品)及含保守序列的噬菌体克隆，作用43℃，30 min后,加豚鼠抗M13多抗，加HRP-SPA显色，测OD490，计算抑制百分率。
2 结果
2.1 肽库筛选 进行四轮筛选,每一轮结束后均记录噬菌体投入量及回收量(TU:四环素转导单位),并计算回收率。结果见表1。
表1 用5G1筛选肽库的结果
Tab.1 The result of screening peptide library with 5G1
Screening Inputing phage
(TU) Recovery phage
(TU) Recovery
(%)
1st 2.64×1010 1.76×105 6.65×10-4
2nd 3.43×1011 2.61×106 7.60×10-4
3rd 2.20×1011 2.61×106 1.19×10-3
4th 2.53×1010 0.55×106 2.17×10-5
2.2 阳性克隆筛选 利用3种ELISA方法对随机挑取50个筛出的噬菌体克隆进行5G1结合筛选。选出结合较好的31个噬菌体克隆用于DNA序列分析。结果参见文献［9］。
2.3 DNA序列分析 对31个噬菌体克隆进行DNA序列分析，结果表明①Ser、Ser、Phe在序列中出现机率较多。②得到两种保守序列：Ser-Ser-Phe包含在4个序列为Ser-Ser-Phe-Tyr-Pro(Leu)-Ile的噬菌体克隆中；Ser-Ser-Arg包含在10个序列为Lys-Phe(Cys)-Ser-Ser-Arg-Leu(Lys) 的噬菌体克隆中(见表2)。
表2 DNA测序所得的氨基酸序列
Tab.2 Amino acid sequences deduced from DNA sequences
No Sequence
2 Lys-Phe-Ser-Ser-Arg-Leu
3 Ser-Arg-Arg-Trp-His-Asn
5 Lys-Phe-Ser-Ser-Arg-Leu
6 Lys-Phe-Ser-Ser-Arg-Leu
7 Lys-Phe-Ser-Ser-Arg-Leu
10 Lys-Phe-Ser-Ser-Arg-Leu
12 Lys-Phe-Ser-Ser-Arg-Leu
13 Thr-Phe-Val-Lys-Ala-His
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