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酸性同功铁蛋白单克隆抗体免疫学特性的研究 |
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erritin， AIF)，并以此为抗原，制备了特异性抗AIF单克隆抗体(McAb)，旨在研究这些McAb的免疫学特性，为抗AIF McAbs应用于临床提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料 多缓冲交换剂94、多缓冲液74、Sephadex G-200、聚焦电泳凝胶及pI标准购自Pharmacia公司；McAb制备成套试剂及各参考铁蛋白购自Sigma公司；酶标兔抗鼠Ig抗血清和免疫组织化学LSAB试剂盒购自Dako公司，McAb Ig亚类试剂盒购自宝灵曼公司，其余均为国产分析纯试剂。10例正常、30例慢性肝炎、肝硬化和38例PHC肝组织标本由武汉市第二医院及湖北省肿瘤医院病理科提供。
1.2 方法
1.2.1 人胎盘和PHC组织AIF的制备 组织匀浆加热至72℃，维持3～5 min，离心取上清，用醋酸溶液将上清液pH调至4.6，上清液经50％硫酸铵沉淀，过Sephadex G-200柱，收集纯化的AF,上样于多缓冲交换剂94柱，使用8～10倍床体积的多缓冲液74洗脱，对洗脱液同时进行紫外和pH值的监测。
1.2.2 AIF的鉴定 样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,对凝胶用0.2%亚铁氰化钾和0.1％考马斯亮兰分别进行铁和蛋白质染色，使用分析型聚焦电泳测定样品的pI值。
1.2.3 McAb制备 按常规方法进行Balb／c鼠的免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选、阳性细胞株的克隆化以及腹水抗体的制备与纯化。
1.2.4 抗AIF McAb的鉴定 McAb特异性鉴定： 以AIF及各参考抗原作为包被抗原，包被浓度为5 μg／ml，酶标兔抗鼠Ig抗血清为第2抗体，使用间接ELISA法测定。参考抗原有碱性同功铁蛋白(BIF)、马脾铁蛋白、大鼠肝铁蛋白、人肝铁蛋白和人白蛋白。McAb Ig亚类测定：采用夹心ELISA法，按照试剂盒说明书进行操作。腹水抗体效价测定：采用间接ELISA法。AIF包被浓度为5 μg／ml，以测定孔A450 值＞对照孔2倍的最大稀释度表示。McAbs表位特性的测定：采用抗体竞争抑制性结合ELISA法，测定McAb间的相互抑制率。
1.2.5 免疫组织化学染色 使用LSAB法，同时设置相关的阴性对照。
2 结果
2.1 AIF的分离、纯化 铁蛋白粗提物经Sephadex G-200柱纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示2个洗脱峰均为单一区带，其中峰1电泳后，铁与蛋白质染色均为阳性，峰1为AF。AF经聚焦层析分离，洗脱液pH由6.2递减至4.0。我们将洗脱液pH≥5.2和≤4.7的部分分别称为BIF和AIF。用聚焦电泳分析BIF和AIF，图1显示BIF各区带分布在5.8～6.3之间，而AIF则分布在5.2～5.8之间。
2.2 抗AIF McAb细胞株的建立 经过数次细胞融合及克隆化，共筛选出 5 株抗人胎盘AIF McAb
（2f8、4g7、4g8、5c3、7a9）和2株抗PHC AIF McAb（4c9、4e2）。这些细胞株在体外连续培养4个月以上均能稳定分泌特异性McAb。
2.3 抗AIF McAb的免疫学特性
2.3.1 McAb的特异性 使用纯化的AIF及各种参考抗原来检测抗AIF McAb的特异性，结果发现7株McAbs与各对应组织AIF结合的A450 值均＞1.20，而与各参考抗原几乎不反应，A450 值≤0.30（检测本底为0.15）。
2.3.2 McAb亚类与效价 Ig亚类测定结果，7株McAb均属于IgG1型，轻链均为k链。各腹水抗体效价分别为：2f8 1.5×10-6，4g7 1.5×10-6，4g8 3.0×10-6 ，5c3 1.5×10-6,7a9 8.0×10-6,4c9 6.0×10-6,4e2 4.0×10-5。
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