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肿瘤坏死因子 诱导淋巴细胞化学发光及其增殖的研究 |
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剂 RPMI-1640(Gibco)按常规配制成完全1640，2-ME(Fluka),DMPO(Sigma)，Luminol(Sigma)按司传平方法配置工作液［3］，MTT(Sigma),黄嘌呤(Xanthine,X，Sigma),黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase,XOD，Sigma)，rhTNFβ(由本实验室制备，电泳纯,细胞毒比活性为5×106 U/mG.P)［4］，其余试剂均为国产。
1.3 淋巴细胞化学发光(LY-CL)的测定
1.3.1 仪器 BPCL超微弱智能发光测量仪(中科院生物物理所)。测量参数：测量时间10 s,标准光源计数1 000 s-1，测量电压1 100 V。测定结果由发光仪10 s计数自动记录，发光值(Relative Light Indensity, RLI)以加TNFβ后出现的Ly-CL值(RLI)的最高峰为峰值，达到峰值的时间为峰时，以对照组的RLI为本底，各处理组的峰值减去本底为纯峰值，并连续测定发光的动力学。
1.3.2 TNFβ诱导淋巴细胞化学发光的检测 取1.0×106 ml-1淋巴细胞或不同密度的淋巴细胞1 ml，加luminol工作液0.2 ml，测其本底后，再分别加入不同浓度的TNFβ或在不同密度的淋巴细胞中加入同一浓度(100 U/ml)TNFβ，并即刻测定其发光值。以此研究不同浓度的TNFβ对同一密度淋巴细胞以及同一浓度的TNFβ对不同密度淋巴细胞诱发Ly-CL(RLI)的影响。
1.4 顺磁共振法检测活性氧［5］
1.4.1 FeSO4 -H2O-DMPO捕捉羟自由基的体系(Fenton反应体系) 依次加入3%H2O2 1 200 μl， 0.1 mmol/L FeSO4 600 μl，0.2 mol/L DMPO 200 μl，混匀后2 min，用石英毛细管吸少量溶液后密封，置ESR谐振室测试。
1.4.2 黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-DMPO捕捉超氧阴离子的体系 取0.3 mol/L黄嘌呤1 200 μl,0.1 mmol/L EDTA 50 μl，0.2 mol/L DMPO 200 μl和1 U/ml黄嘌呤氧化酶500 μl混匀后2 min，取样置ESR谐振室测试。
1.5 TNFβ诱导人外周淋巴细胞的增殖作用 用1640完全培养液调整淋巴细胞，使其在96孔板中每孔细胞密度为1×105 /100 μl和不同浓度的TNFβ/100 μl，置37℃，5％CO2 、饱和湿度条件下培养72 h，实验结束前加10 μl(5 mg/ml)MTT，继续培养4 h，加DMSO 150 μl/孔置振荡器上振荡5 min，用酶标仪测每孔OD570值。
2 结果
2.1 TNFβ诱导淋巴细胞化学发光的动态变化 根据检测,淋巴细胞自身的化学发光值为2 085 RLI。当加入TNFβ后，即可诱导发出较强的化学发光(CL)，不同浓度TNFβ所诱发的Ly-CL及其动态变化有一定差异(图1)。经50 min的间断测定表明，各不同浓度组的峰值出现于18～20 min之间，随后即逐渐衰减，至50 min时已趋平稳。比较各不同浓度组Ly-CL的峰值则以100U/ml组为最高,达到22 997 RLI。值得注意的是500～2 000 U/ml TNFβ的高剂量组，其诱发的RLI，均随剂量的增高而下降。
图1 不同浓度TNFβ诱导人外周血淋巴细胞(1.0×106 ml-1)化学发光的动态变化
Fig.1 The kinetic curves of chemiluminescence indentsity from human PBEC stimulated by TNFβ
2.2 淋巴细胞密度与TNFβ诱导Ly-CL的相关性
表1表明，TNFβ诱导Ly-CL的强度与细胞密度相关。当TNFβ剂量为100 U/ml，淋巴细胞密度为0.2×106～2.0×106 ml-1时，RLI与细胞密度呈线性关系。但随细胞量的进一步提高(＞2.0×106 ml-1)则不再呈现线性关系。
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