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抗纤复方及TGF |
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由美国NIC Crombrugghe教授惠赠（参见图1）［6］，重新构建的重组体所用载体为不含启动子，但含有SV40增强子、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的质粒pCAT-enhancer(promega 结构见图2)。 重组体pCOL0.4、pCOL0.8的启动子分别是以含小鼠α2(Ⅰ) 胶原-2 kb～+54 bp序列的质粒pAZ1009为模板的PCR扩增产物，两重组体分别含小鼠α2(Ⅰ) 胶原基因上游-348～＋54 bp、-780～＋54 bp片段，其正义PCR引物序列分别为：pCOL0.4: 5′-CATAGTCCAAGCTTCTGTAAAGAGCCCACGT-3′；pCOL0.8: 5′-CATAGTCCAAGCTTCCCCTCATCAACGAGAG-3′。上述两种重组体的反义引物相同，序列为：5′-TAGCATCCGTCGACAATCGTGGACCGTTCC-3′。两端引物分别含8个保护碱基和限制性内切酶HindⅢ、SalⅠ识别位点(下划线部分)。PCR按常规方法进行(PE-9600 PCR扩增仪)，扩增产物经纯化回收后，用HindⅢ、SalⅠ酶切并与经相同酶切形成粘末端的线性pCAT-enhancer载体经T4DNA连接酶(promega)连接，连接混和物转染至感受态大肠杆菌并筛选，经小量酶切鉴定正确后，大量扩增阳性克隆，抽提、纯化质粒重组体(Qiagen plasmid midi kit)，紫外分光光度计(Du-600，Beckman)测定得率和纯度。含小鼠α2(Ⅰ)胶原-2 kb～+54 bp质粒pAZ1009亦经扩增、抽提、纯化、定量后-20℃保存待用。
图1 含小鼠α2(1)胶原-2 kb～+54 bp片段(黑色部分)及CAT报告基因的质粒pAZ1009
Fig.1 Plasmid pAZ1009 contains -2 kb～+54 bp fragment of mouse α2(I) procollagen gene (black part)and CAT as reporter gene
图2 含有CAT报告基因的无启动子质粒载体pCAT-enhancer(promega)
Fig.2 Plasmid pCAT-enhancer without promoter and CAT as reporter gene
1.3 DNA转染及 TGF-β、抗纤复方处理 DNA转染采用Dosper脂质体转染法(Boehringer-Mannheim)，具体方法如下： NIH/3T3细胞以5×105 /孔接种于6孔培养板(Nunc)，24 h后，换新鲜但不含FCS的培养基，质粒以脂质体/DNA复合物形式加入上述细胞培养孔中，同时转染碱性磷酸酶表达质粒pSVAP2(Merck&Co. Inc.惠赠)作内对照及含CAT的表达质粒(invitrogen)作阳性对照［7］。转染后6 h，换新鲜含10%FCS的培养基，分别加入TGF-β 2 ng/ml， 中药抗纤维化复方5 、10 mg/ml继续培养36 h后，测报告基因CAT活性。
1.4 CAT及碱性磷酸酶(AP)活性测定 终止培养的细胞用预冷的PBS洗3遍，以裂解缓冲液(Boehringer-Mannheim)裂解细胞后，进行蛋白定量(Bradford法)、AP活性测定(Trace CB171半自动生化分析仪)及CAT-ELISA(Boehringer-Mannheim)定量。
2 结果
我们以含前胶原α2(Ⅰ)基因-2 kb～+54 bp的质粒pAZ1009为模板，PCR扩增得到2个具有相同3′端的长短分别为0.4、0.8 kb的片段分别作为启动子，与不含启动子的载体pCAT-enhancer 分别组成重组体pCOL0.4、pCOL0.8，重组体经酶切鉴定正确(参见图3，1%琼脂糖电泳)。胶原产生细胞(NIH/3T3)在转染上述重组体及pAZ1009后分别用 TGF-β及抗纤复方处理36 h后，ELISA测定细胞CAT表达量，同时测定蛋白浓度及AP活性，AP活性作为内对照以保持转染效率相同条件下比较CAT表达量，CAT测定结果用相应蛋白含量及AP活性校正后，分别以未经处理的细胞转染pCOL0.4、pCOL0.8、 pAZ1009后CAT表达上一页 [1] [2] [3] 下一页
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