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Th1 Th2相关细胞因子基因检测方法的建立 |
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>1.2 PCR引物 5种细胞因子和β-actin的引物序列见表1,均由美国Verginia大学医学院高斌博士提供。
表1 RT-PCR检测Th1/Th2相关细胞因子的引物序列
Tab.1 The primer sequences of Th1/Th2 cytokines by RT-PCR
Cytokine Sequences Length(bp)
β-actin 5 GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3 500
5 CTCCTTAATGTCACGCACGATTT3
IL-2 5 ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT3 458
5 GTTAGTGTTGAGATGATGCTTTGAC3
IFNγ 5 ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTT3 494
5 GATGCTCTTCGACCTCGAAACAGCAT3
IL-4 5 ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCT3 456
5 CGAACACTTTGAATATTTCTCTCTCTCAT3
IL-10 5 ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA3 249
5 GTTTCGTATCTTCATTGTCAT3
IL-13 5 CAGGATCCCCTCCCTCTACAGCCCTCAGG3 300
5 CGGAATTCTTAGTTGAACCGTCCCTCGCG3
1.3 RNA提取 按GIT一步法提取，紫外分光光度法测RNA含量，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。
1.4 RT反应 取1～5 μg RNA，加入0.1 mol/L DTT 2 μl, MMLV 200 U(1 μl)，4×dNTP(10 mmol/L每种) 1 μl, 下游引物P2 0.5 μl(50 pmol), 总反应体积20 μl。37℃ 1 h后，95℃ 10 min灭活MMLV。
1.5 PCR反应体系 20 μl RT反应产物，15 mmol/L MgCl2 13.3 μl，4×dNTP 1 μl，上游引物P1 0.5 μl(50 pmol)，Taq DNA聚合酶2 μl (1 U/μl)，循环条件94℃1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，循环35次，末次72℃，延长7 min，电泳鉴定。
1.6 mRNA斑点杂交 分别含有质粒β-actin、IL-2、IFNγ、IL-4、IL-10和IL-13的大肠杆菌菌株由本室冻存，并按常规方法提取质粒，用切口平移法标记生物素化的各细胞因子探针，按本室常规进行mRNA斑点杂交。
2 结果
2.1 RT-PCR检测Th1/Th2类细胞因子基因表达实验条件的选择 以IL-10为例选择不同RNA量，分别用OligodT12-18、单一下游引物P2和5种细胞因子下游引物做RT反应，用不同RT产物量做PCR反应，结果用1～5 μg RNA，以下游引物P2作RT反应，并取全部RT产物（20 μl）作PCR反应，能取得较好结果。
2.2 RT-PCR检测Th1/Th2类细胞因子的电泳图谱 以HT29细胞为例，图1所示该细胞表达IL-4、IL-10和IL-13，为典型的Th2型细胞，Daudi细胞表达5种细胞因子，为Th0型细胞（既表达Th1类细胞因子，又表达Th2类细胞因子）。
图1 HT29(结肠癌)Th1/Th2类细胞因子的基因表达
Fig.1 Th1/Th2 cytokine genes expression of colon cancer cell line HT29
Note:A.PCR marker:1 000,750,500,300,150,50 bp；B.β-actin；C.IL-2；D.IFNγ；E.IL-4；F.IL-10；G.IL-13
图2 20种人肿瘤细胞株IL-4基因的表达
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