|
中国湖北汉族重症肌无力与HLA |
| |
equence specific primers, PCR/SSP)及PCR/RFLP技术对中国湖北汉族MG患者和正常人群进 行HLA-DRB1 、DQB1和DPB1基因多态性的群体分析，研究中国湖北汉族MG与HLA-Ⅱ类基因的相关性，以期 进一步探讨MG免疫学异常的机制，并为寻找MG的疾病易感基因提供线索。
材料与方法
(一)病例：MG患者91名，均为同济医科大学附属同济医院神经内科门诊病人；正常对照组16 8名，均为湖北省武汉市郊区献血员；二组年龄及性别分布相似，且均为湖北籍随机抽样个 体。
(二)主要试剂：蛋白酶K、Taq聚合酶、琼脂糖(Boehringer Mannheim)，HLA-DRB1与HLA-DQB 1等位基因序列特异性引物(德国ESSEN大学Grosse-Wilde教授惠赠)，dNTP(Pharmacia)。
(三)模板制备：按改进的盐析法从外周血淋巴细胞提取基因组DNA，用紫外分光光度计(Shim adzu Ur-120-02)测定DNA含量及浓度，OD260nm/OD280nm须在1.6～1.8。
(四)用于HLA-DRB1、HLA-DQB1多态性分析的PCR/SSP技术［1］：
1.HLA-DRB1及HLA-DQB1等位基因特异性引物(SSP)：针对HLA-DRB1及DQB1第二外显子多态性 设 计SSP，其所扩增产物具有相应等位基因特异性，分型结果与血清学方法测得的HLA-DR及HLA -DQ表型具有对应关系。SSP只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，从而可 通过PCR反应特异性地扩增该基因片段。
2.PCR扩增体系的成分为：基因组DNA 50～100 ng、Taq酶0.5 U、dNTPs各200 μmol、SS P 2 pmol。PCR反应条件为：预变性94℃ 5 min，然后变性94℃ 30 s；退火65℃ 1 min；延 伸72℃ 1 min，共30个循环。
3.特异性扩增产物的检测：PCR产物经2%琼脂糖凝胶(含溴乙啶)电泳(条件为10～15 V/cm凝 胶，15 min)，经紫外透射在泳道中见明显DNA条带为阳性。
4.PCR反应假阴性和假阳性控制：每一个PCR反应中都含有一对扩增基因和一个保守基因(人 生长激素，350 bp)的引物，对这个保守基因的扩增有可能受到抑制，其作用是作为阳性质 控。
(五)HLA-DPB1的多态性分析采用PCR/RFLP技术：基因组DNA抽提后，DPB1基因第二外显子的P CR扩增，扩增产物的酶切消化，消化片段的电泳分离和显示等见参考文献［2］。DP B1基因第二外显子扩增引物核苷酸顺序如下：
PB101N： 5’-GTGAAGCTTTCCCCGCAGAGAATTAC-3’
PB201： 5’-GTCGCGGCTCCACTCACTGACGTCCAC-3’
用于消化扩增产物的限制性内切酶为Bsp1286Ⅰ、FokⅠ、DdeⅠ、BsaJⅠ、BssHⅡ、Ctr13Ⅰ 、RsaⅠ、EcoNⅠ、AvaⅡ
(六)统计处理：采用直接计数法计算等位基因频率。相对危险性(relative risk, RR)按Woo lf公式计算：RR=ad/bc。式中a为群体中携带某一特定HLA型别的患者数；d为不携带某一 特定HLA型别的正常对照人数；b为不携带某一HLA型别的患者人数；c为携带某一特定HLA型 别的正常人数。RR值显著性检验采用精确概率P值法，并经校正(Pc)。P值的 计算按下列公式：
Pc=P×等位基因个数
结 果
一、MG与HLA-DRB1等位基因的关联：
MG患者携带HLA-DRB1*0901等位基因频率明显高于正常组，RR值为4.12，差异显著( Pc＜0.01)；DRB1*0301等位基因频率明显低于正常组，RR值为0.28，但经校正 后差异无显著(Pc＞0.05)，结果见表1。
二、MG与HLA-DQB1等位基因的关联：
MG患者组HLA-DQB1*0303等位基因频率明显高于正常组，RR值为3.04，差异显著(Pc ＜0.000 1)；DQB1*0604等位基因频率明显低于正常组，RR值为0.063，经校正后差 异无显著(Pc＞0.05)，结果见表2。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 血管内皮生长因子及其基因在自发性高血压大鼠心肌中的表达
下一个医学论文： 腮腺炎性睾丸炎患者的激素改变
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文