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血管内皮生长因子及其基因在自发性高血压大鼠心肌中的表达 |
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Ⅱ(angiotensin Ⅱ,A ngⅡ)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和胰岛素样生 长因子(insulin-like growth factor, IGF)等心肌分泌的活性因子在心肌肥大的形成过程 中具有重要的调节作用［1］。
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是新近确定的一种存 在于血管内皮细胞，特异刺激血管内皮细胞增殖的活性肽［2］。随后研究发现正常 心肌细胞有VEGF及其基因的表达［3］，故VEGF也属心源性活性肽。最近研究发 现由肺动脉狭窄引起的右心肥大心脏的心肌细胞VEGF基因表达增强［4］，提示VEGF 可能参与心肌肥大机制。但目前尚未见高血压肥大心脏心肌VEGF变化的研究报道。本实验采 用免疫组化和Northern分子杂交方法，通过对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertens ive rats, SHR)心肌VEGF及其基因表达的研究，进一步探讨心肌肥大形成的内分泌或旁分泌 机制。
材料与方法
一、材料：
体重200～230 g雄性SHR和WKY大鼠各6只，购自北京阜外心血管医院动物科。兔抗人VEGF多 克隆抗体和SPTM试剂盒为Zymed产品。VEGF cDNA探针由美国国家卫生研究院(NIH)Marvin. O.B oluyt教授馈赠。β-actin cDNA探针购自华美公司。随机引物标记试剂盒为Pro mege产品。［α-32P］-dCTP购自北京亚辉生物工程公司。其余试剂为Sigma产品和 国产分析纯。
二、方法：
(一)血压测定和心肌肥大计算：大鼠禁食自由饮水24 h后，称体重(BW)，戊巴比妥钠 (35 mg/kg.ip)麻醉。经颈总动脉插管，用RM-6000生理多导仪测颈总动脉血压。然后开胸 取 出心脏，4℃预冷生理盐水冲洗，沿室间隔剔除心房和右心室，称左心重(LVW)。心肌肥大程 度以心系数(LVW/BW)表示。
(二)免疫组化实验：常规石蜡切片。按试剂盒说明操作。特异性一抗VEGF 1∶1000 稀释，阴性对照用PBS代 替。湿盒4℃过夜。生物素标记的二抗1∶200稀释，37℃孵育30 min。辣根酶标记的链霉卵 白素1∶200稀释，37℃孵育30 min。新配制DAB显色，苏木素复染。用于图象分析的切片不 复染。
(三)Northern分子杂交：两只大鼠心脏合并一例。异硫氰酸胍一步法提取总RNA。1 %琼脂糖凝胶行甲醛变性电泳 分离RNA，虹吸印迹法转移RNA至尼龙膜上。80℃干烤2 h后保存。VEGF和β-actin cDNA探 针采用随机引物标记法标记［α-32P］-dCTP同位素。42℃预杂交24 h后，杂交24 h 。-70℃放射自显影4～7 d。VEGF和β-actin用同一张膜杂交。先杂交VEGF，用5 0%甲酰胺和0.1%SSPE洗膜并经放射自显影确认无杂交信号后，再进行β-actin杂交。
(四)统计处理：免疫组化结果用组织切片表示。杂交结果用放射自显影斑点图表 示，并用ISAS2000图 象分析系统对组化切片特异染色颗粒和分子杂交斑点进行半定量分析，其结果用光密度平均 值(OD)表示。免疫组化切片每组分析5张，每张取5个视野的平均值。血压和心系数用±s表示，采用方差分析组间q检验行统计处理。
结果
WKY大鼠心系数(2.21±0.18)mg/g。SHR心系数(3.56±0.27) mg/g，比WKY大鼠提 高61%(P＜0.01)。WKY大鼠血压(12.27±1.06/10.40±0.53) kPa。SHR血 压(24 .93±0 .93/23.33±1.60)kPa，比WKY大鼠收缩压增加103%，舒张压增加124%(P＜0.01)。
免疫组化结果表明，WKY大鼠心肌细胞胞浆内有一定量VEGF特异褐黄染色颗粒(图1-A)。 SHR心肌细胞胞浆内VEGF特异褐黄染色颗粒明显多于WKY大鼠(图1-B)。图像分析结果表明，S HR心肌细胞胞浆内特异染 色颗粒灰度OD值为1.01，比WKY大鼠心肌OD值0.53高出91%(表1)。
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