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缺氧预处理对自发性高血压大鼠心肌细胞内钙的影响 |
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近年来研究提示细胞内的信号转导异常在心肌肥厚的发生发展中起着 重要作用。细胞本身由特异的信号转导系统所调控，信号转导途径或相关分子表达异常，可 引起细胞生长及功能失控，导致机体组织病理性改变。G-蛋白作为一族特殊的调节蛋白，以 其特定方式偶联着膜受体与效应器，后者如腺苷酸环化酶、磷脂酶C及离子通道等，参与细 胞跨膜信息传递，其中百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)敏感的G-蛋白主要为抑制性G-蛋 白(Gi-蛋白)，参与心脏活动及功能的调节；蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)则与细胞 许多关键蛋白质的磷酸化有关［1］。近年对缺氧预处理的研究多采用正常动物，与 临床心肌缺血可能有较大差距［2，3］。为探讨缺氧预处理对高血压肥厚心脏的保 护作用及信号转导机制，实验利用分离的SHR心肌细胞，研究了缺氧预处理对后继缺氧再给 氧所致心肌细胞内钙超载的影响，以及PKC和PTX敏感的G-蛋白在缺氧预处理中的作用。
材料与方法
(一)试剂：百日咳毒素、Staurosporine、Fura-2AM、MEM培养基及胶原酶皆为Sigma产品，E GTA系潮州生物化学厂生产，其余试剂皆为国产分析纯。
(二)动物：自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)购自上海高血压病 研究所，饲养至40周进行心肌细胞分离。此时已证明心肌细胞肥大。
(三)心肌细胞分离方法：参照Inoue报道［4］以0.1%胶原酶进行循环灌流以分离心 肌细胞。镜下可见心肌细胞结构完整，条纹清晰，80%以上胎盼蓝排斥反应阳性。
(四)心肌细胞内游离钙(free calcium,［Ca2＋］i)测定方法［5］：利用急 性分离的SHR心肌细胞悬液，用终浓度为5 μmol/L Fura-2AM在37℃水浴中负载25 min，然 后分别以细胞外钙浓度(［Ca2＋］。)1.0 mmol/L的改良Hanks氏液和无外钙并加 入 1.0 mmol/L EGTA的Hanks氏液清洗细胞三次，以去除细胞外的Fura-2AM。将负载好的细胞 悬液100 μL加入特制的中心有容积孔的载玻片中，以AR-CM-MIC阳离子测定系统(美国SPEX 公司产品，可选取镜下单个心肌细胞描记其荧光变化)，荧光激发波长分别为340 nm和380 n m测定心肌细胞［Ca2＋］i。心肌细胞［Ca2＋］i计算公式为：［Ca 2＋］i＝Kd×(Sb1／Sb2)［(R-Rmins)/(Rmax-R)］,其中Kd为Fura-2 -Ca 2＋解离常数，R为观察到两激发波长荧光比值(F340/F380)；在37℃下Kd为224 nmol/ L；R max为细胞内Fura-2被Ca2＋饱和时的两激发波长荧光比值，通过加入离子载体lon omycin 20 μmol/L测得；Rmin为Fura-2完全游离，未与Ca2＋结合时两激发波长的 荧光比值，通过加入EGTA 20 mmol/L测得；Sb1／Sb2为Fura-2在无Ca2＋以 及与Ca2＋结合达饱和状态下，在380 nm处荧光强度之比。细胞自身荧光在没有负载 Fura-2AM时测定，计算［Ca2＋］i前减去细胞自身荧光。
(五)缺氧预处理方法：以纯N2排空空气，进行3次5 min预处理，每次间隔5 min，其间通 以95%O2+5%CO2；并设非预处理对照组，观察两组细胞对其后持续30 min纯N2灌注 及再给予95%O2+5% CO2 60 min对心肌细胞［Ca2＋］i水平的影响。实验共 分8组细胞，每组测定8个细胞，以观察缺氧预处理对［Ca2+］i水平的影响及PKC及PT X敏感的G-蛋白在缺氧预处理中的作用。具体分组如下：
(a):Fura-2AM 负载后清洗液及细胞悬浮液皆为无钙同时加入EGTA(终浓度为1.0 mmol/L)的 H ank 氏液，3次缺氧预处理后间隔30 min再进行30 min持续纯N2灌注及再给予95%O2+5 % CO260 min，测定心肌细胞［Ca2＋］i水平；(b):未进行缺氧预处理直接进行 30 min持续纯N2灌注及再给予95%O2+5%CO2 60 min，其余条件同a组，测定心肌细 胞［Ca2＋］i水平；(c):缺氧预处理前以PKC拮抗剂Staurosporine(10 nmol/L)处理 细胞10 min，其余条件同a组；(d):缺氧预处理前以Gi-蛋白失活剂PTX(200 ng/L)处理细胞5 h，其余条件同a组；(e):Fura-2AM负载后以细胞上一页 [1] [2] [3] 下一页
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